植物工厂化育苗教学课件 4实验室及管理

实验室及管理——植物工厂化育苗

植物组织培养实验室设计及主要仪器设备

组培技术需要依托实验室及相关仪器设备进行生产操作实验室怎样选址，怎样布置合适？实验室环境有什么要求？仪器怎么使用，注意事项？

（一）实验室选址实验室选址原则：1．周围没有污染源（没有利于微生物滋生的条件）。如养鸡场、养猪场等；2．没有工厂等的有毒气体排放、污染水源，不利于组培苗移栽；3．不要组建在市中心；但又交通方便的城市近郊。应在城市常年主风向的上风向，避开各种污染源；4．选在楼层中的高层较好，微生物在地面或近地面的地方易于生长。实验室布局工艺流程通常按自然工作程序先后，安排成一条连续的生产线，避免有的环节倒排，增加日后工作的负担或引起混乱。按照工艺流程进行布局，组培苗生产环节为主线合理布局。

工作流程相匹配实验室洗涤间：洗瓶玻璃器皿容器及存放药品室配培养基实验室：培养基配置、分装灭菌室：培养基的灭菌工作

无菌操作室（接种室与缓冲间）用于植物初代、继代、生根培养的接种过程培养室用于初代、继代、生根培养阶段的组培苗的培养温室组培苗的炼苗、移栽等过程

苗圃

成形的商品大苗商品组培苗培养基的配置接种

组培苗培养移植

小苗培养组培的几道主要工序如下：培养器皿的洗涤；培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌；无菌操作---材料的表面灭菌和接种；组培苗培养(初代继代生根培养)；试管苗移栽与初期管理。理想的包括：洗涤室、准备室、药品室、缓冲室、灭菌室、无菌操作室（接种室）培养室、温室或大棚。规模大条好的，几道工序可以分别在好几间实验室里完成。规模小，条件有限的可以合并实验室使用。

（二）实验室的基本组成1．化学药品室

植物组织培养需要几十种化学药品，这些药品的质量和保存直接影响到培养效果。保存药品的环境条件严重影响到药品的质量和可用期限，如环境温度、湿度和光照等，为了满足这些条件，建立一个单独的药品室是必要的。

药品橱：注意事项：将固体药品和液体药品分开，大包装与小包装分开，常用药品与不常用药品分开，危险、易燃、易爆、有腐蚀性的药品与普通药品分开。药品橱的设计以内部阶梯式结构较为合理，药品的摆放应按一定的顺序，每一阶梯层上摆放一行，这样看起来一目了然，十分便于工作。建立药品购进和使用档案，记录药品的购进日期、数量，取用的数量、日期及使用人员等，以利于工作的开展。实验台设置必须牢固、平稳，具有较好的抗震性能。试验台配置防腐蚀台面。

实验台上要摆放一台万分之一的电子天平和一台百分之一的电子天平。在实验台的抽屉内存放称量药品用的药匙、称量纸（光滑滤纸）、毛刷、卫生纸等。

药品室内还可存放一些干燥的、暂时不用或利用率较低的玻璃器皿或其他实验用品，如脱脂棉、滤纸、纱布等，这些物品应单独存放在一个橱子内或在药品橱内设置独立的隔层。培养基配置室面积至少40平方米，空间足够大，操作方便。配制培养基区应有大型实验台若干个，数量多少由工作人员多少和工作量的大小以及房间的面积而定。实验台的高度最好以人站着操作比较舒服为宜。该区还应配备常规配培养基所使用的设备及仪器：冰箱一台，电炉（1000W，2000W）或电磁炉，放置移液管、微量移液器的架子，酸度计、烧杯、量筒等仪器设备。2．培养基配制实验室

用途：

配制培养基的各种母液，包括大量元素、微量元素、有机溶液、铁盐、各种激素

应配置的仪器：

蔗糖、琼脂和粗天\分析平也放在此区。量取各种母液所用的移液管、吸耳球、量筒、微量移液器的吸头等都应尽量干净，以防止在量取母液时污染母液。

注意：配制培养基时，使用过的玻璃器皿、容器、用品等需要清洗的要及时送到清洗区进行清洗，一时来不及清洗的也应加上自来水，以防剩余的培养基、化学溶液等干结在器皿上。

3、灭菌室功能：培养基、器皿、工具等灭菌。环境：耐湿，耐通风，安置排风扇以保证通风良好。墙面地面耐潮湿

最好与配制培养基的实验室相邻或尽量靠近，因配制好的培养基和一些器皿需要尽快进行高温高压灭菌，如果两处相距太远会给工作带来诸多不便。室内需备有高压灭菌锅及烘箱等设备。4．洗涤室

完成培养容器、玻璃器皿、用具的清洗、干燥和贮存以及初代培养中外植体材料的清洗。环境：地面注意防滑，排水通畅，墙壁防湿防潮设置：洗涤室应设置大型水槽，工作台面、上下水管道、落水架、干燥箱等。洗涤室配备手推车用于运输培养器皿。化学实验室（置天平和药品）与洗涤灭菌室分开。

无菌工作的场所，如材料的灭菌接种，无菌材料的继代，丛生苗的增殖或切割嫩茎插植生根等，它是植物组织培养研究或生产工作中的最关键的部分关系到培养物的污染率、接种工作效率等重要指标。

环境：干净、干爽、安静、清洁明亮，墙壁光滑平整不易积染灰尘，地面平坦无缝，便于清洗和灭菌。最好采用水磨石地面或水磨石砌块地面，白瓷砖墙面或防菌漆天花板板面等结构。门窗要密闭，一般安装滑动门，减少空气对流，以防外界菌类及尘埃的侵入。设备：

紫外灯，用于紫外线灭菌，保持良好的无菌或低密度有菌状态。

空调，调整保持无菌室内合适温度，可以门窗紧闭，保持与外界相对隔绝的状态，尽量减少尘埃与微生物侵入。密闭的空间，经常采用灭菌措施，就可达到较高的无菌水平，以利安全操作，提高工作的质量与效率。操作台和搁架，分别用以放置组培的操作器具和灭菌后待接种的培养瓶等。5．无菌操作室（接种室）设置：超净工作台、医用小平车。超净工作台上放酒精灯和装有刀、剪、镊子的工具合（常用饭盒或搪瓷盘），灭菌用的酒精（75%与95%两种）、外植体表面灭菌剂（0.1%HgCl2等）以及吐温、无菌水等。医用小平车6.缓冲室

功能：

辅助无菌接种的准备工作，

操作人员在缓冲间更衣、换鞋洗手进入无菌室。配置超净台灭菌药品。防止带菌空气进入接种室及工作人员进出接种室时带进去杂菌。最好安装1盏紫外灯，用以灭菌。

墙上设衣帽钩，门边摆拖鞋或设1鞋箱。

安装水池。功能：培养离体材料场所，一般30-40平方米。位置：最好与接种室相邻。环境要求：无菌培养室最重要的是要恒温、恒湿，无尘且空气流通，空间微生物含量低。温度应维持在（25±2）℃，相对湿度应在50%—60%。向阳或加大窗户利于接收自然光线。7．培养室培养架：年产4～10万苗需培养架4～6个，年产苗10～20万约需8～10个。培养架的高度可以根据培养室的高度来定，每个架子分为若干层，每层的层高应在40cm左右，太高浪费空间，太低则上下层温度影响太大，架宽应在45cm左右。最下一层距地面0.2米。层间距30厘米。每盏灯有开关、每个架子有个总开关，以便随时随地视具体情况来调节光照强度；而每天光照时间的长短则由缓冲室配电板上安装定时器控制。紫外灯：

定时对整个房间进行杀菌处理，夏天潮湿、霉雨季节，最好每天在晚上用紫外灯杀菌30min以上。培养室内的地面、墙壁、培养架及所有器物的表面都应经常清洗、擦拭以防过多灰尘和微生物滋生。尤其是培养架顶端以及培养架底端容易被忽视

进入培养室最好穿戴干净拖鞋或穿一次性塑料鞋套，非工作人员最好少进入培养室。出入人员出入所带的尘埃，拖地扫地，空调扬起的灰尘都会造成感染。9．驯化移栽室当试管苗长出一定量的不定根，根长在0.5cm～1cm时，及时移栽驯化。驯化室通常是在温室的基础上营建。

驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。面积大小视生产规模而定。驯化温室10.温室

为了保证试管苗不分季节地周年地生产，必须有足够面积的温室与之配套。温室内应配有温度控制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置。一、实验室设立原则各实验室分布要按照（工作流程或工艺）进行布局标准进行设置包括哪些实验室，其环境要求，及特别需要注意的几个事项（洗涤室、准备室、药品室、灭菌室、缓冲室与无菌操作室、培养室）准备室和药品、洗涤室和灭菌、常用仪器配备。仪器使用时一些注意事项天平分为（分析天平）（粗天平），称量时称量重量精确到（），称量的滤纸应使用（）滤纸，连续称药品时注意称重前需要（清零）

再继续称量高温灭菌器使用时注意的细节：

玻璃器皿使用，常用的器皿有哪些，用途是什么，一些注意事项：烧杯、量筒、定容瓶、玻璃棒、移液管、大试剂瓶调pH值与培养基软硬程度。均衡、水解、下降0.2-0.4.余热水解-培养基稀。二、什么是植物激素、人工调节剂，具体包括哪几类逆境激素。生理活性物质是移动的。下-上IAA类生长素类的药品：IAA、IBA、NAA

\

2,4D盐酸溶解95%CK类药品有哪些，用什么溶解，作用ZT\KT\BA溶解Hcl,zt

乙醇上-下嫩茎。衰老赤霉素怎样溶解，注意冷水，酒精分解冷藏抗生素作用：外植体灭菌表面，不容易诱导分化，生根可以尝试用（天然复合物）尝试调节组培中提供碳源的是：糖-蔗糖-维持渗透压，低渗透，植物吸水

，易吸收

，抑制微生物繁衍

便宜绵白糖实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室基本实验室布局平面图Ⅱ、一般的组培实验室包括：一、设置二、准备三、注意事项

二、设备仪器1、准备室①天平，1/10000、1/1000的分析天平、粗天平②电炉（放烧杯）、电磁炉（锅）③高温灭菌锅小型手提式1000-2000W25L

中型立式大型卧式④电冰箱⑤蒸馏水器⑥玻璃器皿、备品、杂品、药品（移液管、烧杯）⑦干燥箱⑧培养容器（培养瓶）试管→小三角瓶→代用瓶→专用平（塑料瓶、玻璃瓶等）效率低昂贵果汁瓶等，成本低2、接种室①超净工作台---单人/双人垂直风幕，直接吹到材料上，材料易风干水平风幕②紫外灭菌灯—打开后，5分钟内，局限于照射到的范围；5分钟后，紫外光激发空气中氧气→臭氧，臭氧本身灭菌，③操作工具—手术刀（可换刀片）、镊子、手术间（不用碳钢，因为易生锈）、酒精灯。3、培养室空调（工作时舒服、避免流汗污染）20平方米以下1P1台；20-40平方米，2P，1台/1P、2台；培养架（木制、金属焊接、金属组合）150瓶/层。培养架

三、注意事项（一）准备室----保证安全1、水电的相对安全2、易燃、易爆药品（新洁尔灭）要远离热源，避光储存；易挥发、易腐蚀、易吸潮的药品要小心存放。（二）接种室

1、使用前注意清扫、除尘、灭菌、熏蒸。（0.2克高锰酸钾+2毫升福尔马林）/立方米，2毫升福尔马林加入到0.2克锰酸钾中，倒过去后发烟，烟起到熏蒸的效果，密闭24小时，杀灭门窗缝隙的微生物，打开门窗散味，一周后使用。

2、平时管理

①不能堆放与工作无关的物品和人；②高度洁净无尘，地面、墙面、工作台面保持洁净；

③经常进行常规灭菌---紫外灯照射、化学灭菌75％酒精或2％新洁尔灭喷洒，对天花板喷洒，细雾滴滴落，杀灭空气中的细菌，但只是一部分，一般情况下一个月处理一次。（三）培养室1、同接种室（初次使用时）2、平时管理①光照定时器要注意调节（尤其停电时候②污染的培养物及时清除（温度适合菌的生长，等孢子扩散，使培养时内全部培养物污染）③经常检查温度、空调、光照条件④分门别类放置培养物（品种、培养阶段）二、实验室的常用设备1.超净工作台：用于培养材料的消毒及接种。

使用：将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。1.超净工作台

根据风幕形成的方式，可分为垂直式和水平式两种；按大小又可分为单人单面、双人单面、双人双面。垂直风幕，直接吹到材料上，材料易风干。水平风幕，

工作原理：

超净工作台装有小型鼓风机，使空气通过双层细菌过滤装置，除去大于0.3μm的尘埃、细菌和真菌孢子

以固定不变的速率从工作台面上流出，在操作人员与操作台之间形成无菌风幕。超净空气的流速为每分钟24－30m，可以防止附近空气袭扰而引起的污染，也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。6．烘箱

可以用80

C～100

C的温度，迅速干燥洗净后的玻璃器皿。

也可以用160

C～180

C的温度，进行1h～3h的高温干燥灭菌。

7．高压灭菌器

用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。分类：大型卧式、中型立式、小型手提式等多种。可根据生产规模选用，大型效率高，小型方便。工作原理：

在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。构造：立式灭菌器主要由总阀、气压表、放气阀、丝杠扳手、紧定丝母、水碗、进水阀、水位线标志、排水阀、夹层压力表等零部件构成。使用①加水：打开进水阀，向水碗注入清水直至水位到标志线为止，然后关闭进水阀；②移开上盖装入物品；逆时针方向旋动丝杠扳手使上盖离开上口后，推动横梁移开上盖，装入灭菌物品，注意留有空隙以利消毒彻底；③关闭上盖；顺时针转动丝杠扳手直至紧到不能转为止；④接通电源，使灭菌器开始工作。当压力表指针升到0.05MPa时，打开放气阀放出冷气，直至回零，关闭放气阀，使灭菌器继续工作。⑤当压力达到0.10MPa时，开始计算时间，使压力表保持0.10-0.15的范围，维持一定灭菌时间，不同消毒物品所需时间不同，一般灭菌20～30min。⑥放气取物。当灭菌到所需时间时，断开电源，让压力自然下降。当达到0.05MPa时可放出蒸气，至零时，打开锅取出物品。注意事项：①对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；②对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min；③高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。因此，调PH值时，可适当调高0.2－0.3个单位。④当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。⑤高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要部件，不得随意调节。9．天平分析天平和电子天平等。

分析天平：微量、激素药品粗天平：大量药品、糖、琼脂

天平应放在干燥的固定操作台上，应避免振动和腐蚀。

注意事项：去皮称量、预热30分钟、误差0.02mg以内、硫酸纸称取12．摇床（振荡培养机）在液体培养中，为了改善浸于液体培养基中的培养材料的通气状况，可用摇床来振动培养容器。振动速率每分钟60～120次为低速，每分钟120～250次为高速，植物组织培养可用每分钟100次左右。13．转床（旋转培养机）

液体培养。由于旋转培养使植物材料交替地处于培养液和空气中，所以氧气的供应和对营养的利用更好。通常植物组织培养用1分钟1转的慢速转床，悬浮培养需用80～100转/分钟的快速转床。14．蒸馏水发生器

植物组织培养中常使用蒸馏水。构造：主要由冷凝器、回水管、进水阀、蒸馏水出口管、水位表、蒸发锅、水碗、放水阀、电源指示灯等零部件构成。工作原理：为蒸发锅加热后向上产生水蒸气，当水蒸气遇到凉的冷凝器便凝结成水滴从蒸馏水出口管流出。无菌水：已经灭菌的自来水及已经灭菌的蒸馏水、已经灭菌的去离子水三、器皿与用具

（一）组培器皿1．培养器皿是指用于放入培养基和培养材料进行培养的器皿。要求透光度好，能耐高压灭菌。按其制作材料分：主要有玻璃培养器皿与塑料培养器皿两种。玻璃培养器皿：透光度好、容易清洗，缺点是容易破碎；塑料培养器皿：不容易破碎、成本较低，但缺点是透光度较玻璃培养器皿差、遇火焰易被熔化。①试管

占空间小，单位面积可容纳的数量较多，所以初代培养及试验处理较多时使用比较方便。通常以2.0cm×15cm、2.5cm×15cm、4.0cm×15cm为好。试管可在灯光下直立放置，以便更好的利用光能。②三角瓶培养面积大，利于组织生长，受光好。瓶口小，也有利于减少污染。③培养皿适合于游离细胞、原生质体、花粉等的静止培养。有6、9、12cm等规格，要求上下能密切吻合。④果酱瓶或罐头瓶

成本低；瓶口大，大量繁殖时操作方便、工作效率高；透光性好。生产中应用较多的是200ml的果酱瓶，加盖半透明的塑料盖。⑤瓶口封塞

要求：要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。1）以前用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。2）用聚丙烯塑料薄膜，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。3）也可采用专用的封口膜。2.盛装容器①试剂瓶包括无色和棕色两类。细分为广口瓶、细口瓶，规格从50-1000ml不等。用于盛装母液。棕色瓶用于见光易分解的药液的储存。②滴瓶盛装酸液或碱液，用于调节培养基的pH值。③烧杯药品溶解时使用，加石棉网电炉使用。

不能用于定容，定容瓶和移液量筒移液管

型号：1000ml\100ml\50ml

3.计量容器①容量瓶容量瓶主要用于准确地配制定容量溶液。

细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞。瓶颈上刻有标线，当瓶内液体在所指定温度下达到标线处时，其体积即为瓶上所注明的容积数。

一种规格的容量瓶只能量取一个量。常用的容量瓶有100、250、500、1000ml毫升等多种规格。植物组织培养中用于配制培养基母液时定容。②移液管用于吸取各种母液和激素溶液。规格有0.1-10ml。③量筒用于量取各种母液。规格有10-1000ml。（二）器械用具1.镊子材料的接种以长16-25cm的不锈钢枪状镊子为好。由于镊子有一定的角度，且尖端圆钝，所以在培养瓶中操作方便，也不致伤害材料。镊子过短，容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。2.剪刀

立体快繁时，继代培养需要在培养瓶内大量剪取茎段，进行转接，常用医用解剖剪刀。3.解剖刀用于切割接种材料。刀片应该经常更换，以保持锋利状态，否则影响接种速度，也会造成植物材料不必要的损伤；

防止酒精灯长期烘烤刀片氧化，在植物材料切割处留下铁屑，影响材料吸收养分。1．温度

温度决定植物材料的呼吸速率和控制植物组织代谢过程的化学反应，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。培养室一般要求较好