DB37T 3532-2019 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法　　

DB37Identificationofcaprine，sheepandbovinederReal-timefluorescentPCRmet山东省市场监督管理局发布I 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 71羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法GB/T6682分析实验室用水规格GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用25.2材料103.4KPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，降至室温，4℃保存备用。0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（pH6.4振荡型恒温金属浴：0℃~100℃。36.6低温冰箱：-20℃~4℃。6.9容量瓶：10mL，50mL首先收集白细胞：取液态羊奶2mL，或者奶粉20mg溶于2ml无菌水中，每个样品设立2个平行样,将样品于4℃、2500g离心30min；弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLpH7.4灭菌的PBS缓冲液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，离心力3500g，43000g离心1min，取出PCR9试验数据处理9.2检测结果分析和表述则需要加大模板量进行PCR反应。若再次扩增5A.1实时荧光定性PCR引物和探针序列AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTAGATTGCGCTGTTATCCCTAGGACCGTTACCGAGTCCAGGTG5’ROX-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGN-P5’JOE-ACAATCTCCATGAGTTGGTAGTTTCG5’CY5-CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCA.2实时荧光PCR反应体系加量(μL）Mix221-3ng/µL2A.3对各种样品检测结果的判定6+-+未检出牛源性成分或含-+未检出羊源性成分或含++检出牛和羊源性成分未检出牛和羊源性成分--如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际样品时只有CY5荧光检出，无JOE、ROX---PCR反应失败。注意以下几个方面后再次进行7B.1山羊（Caprahircus）PCR产物序列（GenBank:KY52351山羊（Caprahircus）PCR产物序列（GAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTAAGGGATAACAACATCCTTTAACTAGCAGTTTTGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAAGAGATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTTACAAGTCAAATCAAATTGCTTATTGATCCAAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCB.2绵羊（Ovisaries）PCR产物序列（GenBank:KP702285.绵羊（Ovisaries）PCR产物序列（GenBank:KP7022AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGAAAATAAATTCAACCACCAAGGGATAACAACACTCCTTAGTTAACAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAGAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTAACAAGTCAAACCAGCTTATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACCAACCCAAAGAGAATAAATTTAACCATTAAGGAGTAACAACAATCTCCAGTTGGTAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAATAAAAAACCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACCCACAAGTCAAATCAGCTCATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGACCGTTACCGAGTCCAGGTGAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGACGACGGTCCTTTCTAATGTGAA