DB37T 3127-2018 禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范

DB37DB37/T3127—2018禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范山东省质量技术监督局发布IDB37/T3127—2018本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏。1DB37/T3127—20181范围和技术要求。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB14925实验动物环境及设施下列术语和定义适用于本文件。3.1是波氏杆菌属(ThegenusBordetella)四个种中的一个新种，1984年由Kersters3.2无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。3.3间接酶联免疫吸附实验indirectenzy应后再洗板，加入底物显色。2DB37/T3127—2018禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。4.2禽波氏杆菌阳性血清SPF鸡经免疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清，每次免疫间隔两周。4.3阴性血清从SPF鸡分离的血清。4.4待检禽血清采集禽的血液，于37℃温箱中静置2h,收集析出的血清。4.5生化试剂灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HC1、牛血清白蛋白(BSA)、底物反应液(具体配制方法见附录A)。5仪器设备5.1平板(玻板、白瓷板或载玻片)。5.3接种环。5.4试管架。5.5小试管(口径8mm～10mm)。5.6灭菌吸管(1mL)。5.7恒温培养箱。5.8匀速振荡器。5.10酶标仪(波长范围340nm～850nm)。6禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验6.1用20μL微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌P5株标准抗原于平板上。6.2再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混合均匀，3min～5min观察结果。6.3平板凝集试验可参考图1:阳性抗原阳性抗原襟阳性血清阴性血清待检血清3DB37/T3127—2018果有效。6.4.3待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。7.2.1.1为每份血清准备小试管5支，第一管加入2.3mL石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5mL石炭酸生理盐水。加入到第二管中，混合均匀，再吸取混合液0.5mL加入到第三管，同样混匀，从中吸取0.5mL加入第四管混匀，再从第四管吸取0.5mL加入第五管，第五管混匀后弃去0.5mL。这样稀释之后，从第二管 (第一管不加，作血清蛋白凝固对照),振荡均匀。加入抗原后，第二至第五管各管混合液的容积均为每次试验均须作阳性血清(Ab*)对照、阴性血清(Ab)对照、抗原(Ag)对照。12345血清终稀释度1:12.50.5%石炭酸生理盐水0.5(Ab)0.5(Ab)待检血清舍去0.5阳性抗原(1:20)4DB37/T3127—2018全部试管于匀速振荡器充分振荡后置于37℃~38℃温箱中22h～24h,然后检查并记录结果。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。100%抗原凝集(++++):抗原全部凝集，呈伞状沉于管底，上清液完全清亮透明；75%抗原凝集(+++):约有3/4的抗原被凝集，管底凝集物与++++相同，只是上清液稍混浊；50%抗原凝集(++):约1/2的抗原被凝集，管底有中等量的凝集物，上清液混浊半透明；25%抗原凝集(+):约1/4的抗原被凝集，管底有少量凝集物，上清液完全混浊不透明；0%抗原凝集(-):抗原完全未凝集，上清液完全混浊不透明，但由于菌体抗原自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点。试管底部凝集程度判定可参考图2:252凝集502凝集75%凝集1002凝集能使50%抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清凝集价(或称滴度)。血清凝集价大于或等于1:50,判为阳性；血清凝集价为1:25,判为疑似反应。疑似反应者，3周后须重新采血，再次进行试验，如果仍为疑似反应时，可判为阳性。8.1.1将保存的禽波氏杆菌株接种于200mL肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。8.1.2用10倍体积的含有10mMMgCl₂的Tris-HC1(100mMpH7.8)缓冲液悬浮，超声波破碎(功率为500W、破碎时间60s、间隙60s、反复破碎10次)。8.1.4含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含2%TritonX-100的Tris-MgCl₂缓冲液溶解，室温下孵育30min降解内膜蛋白后，再进行100000×g,30min超速离心。5DB37/T3127—20188.2.1将提取的禽波氏杆菌OMP蛋白液与弗氏不完全佐剂混合(V:V=1:1),用漩涡振荡器乳化，制备8.2.2选取体重1kg以上的健康鸡4只，肌肉注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次间隔1周，OMP免疫剂量为320μg/只/次。实验鸡的饲养符合GB14928.2.3最后1次免疫后7d采血，用上述试管凝集试验检测血清中鸡抗禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于1:256以上时采血，分离血清，-20℃保存备用。采集SPF鸡的血液，制备阴性血清。8.4间接酶联免疫吸附实验(iELISA)检测8.4.1包被8.4.2封闭用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液(含1%BSA的PBS)200μL,置湿盒内，4℃封闭过夜。用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释鸡抗禽波氏杆菌高免血清(作阳性对照),取1孔加入1:10倍稀释的鸡阴性血清(作阴性对照);其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37℃作用60min。抗体稀释液为1%BSA的PBS。(抗体稀释液为1%BSA的PBS),用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37℃避光显色20min。8.4.6读数以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。6AA(资料性附录)溶液的配置A.1试管凝集试验中灭菌0.5%石炭酸生理盐水的配制称取9g氯化钠(NaCl)溶于水，定容到1L,再加入5mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使用。A.2禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验中相关试剂的配制A.2.1磷酸盐缓冲液(PBS)的配制1mol/LPBS(pH7.2)的配方：氯化钠(NaCl)氯化钾(KCL)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)双蒸水(H₂O)A.2.2PBST缓冲液的配制1LPBS+1mLTwA.2.3牛血清白蛋白(BSA)将100mg的牛血清白蛋白加入9.5mL水中(须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中),盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10mL,然后分装成小份，贮存于-20℃。A.2.4Tris-Hcl缓冲液的配制浓盐酸(1mol/LHCl)42.0mL双蒸水定容至1000mL在900mL双蒸水中加入121.1gTris碱，溶液冷却至室温后调