动物源性饲料中猪源性成分的定性PCR检测方法编制说明

编制说明一、任务来源根据国家认证认可监督管理委员会的标准制(修)订计划安排，行业标准《燕窝的分子生物学真伪鉴别方法》（计划编号为2007B149），归口国家认证认可监督管理委员会，由中国检验检疫科学研究院负责起草工作。二、编制本标准的目的和意义燕窝是由雨燕科金丝燕及同属类的唾液凝结而成的物质，是一种名贵的保健食品。由于燕窝的营养价值较高,消费者对其需求日益增长。而燕窝是一种稀缺资源，世界贸易统计每年收获的燕窝总重量只有大约2000吨。正是在这种供需矛盾和巨大经济利益的驱使下，燕窝市场的掺假掺杂现象十分普遍,造假材料主要包括银耳、猪皮、琼脂、果胶、蛋清等，使消费者蒙受损失。目前缺乏燕窝质量相关的检测标准，十分有必要开展燕窝产品真伪鉴别方法研究并进行标准化，以保证燕窝市场的规范化运行〔1，2〕。三、编制原则本标准的编写是按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行的。本标准是在“十一五支撑项目”《功能性食品有效成分检测和鉴伪技术的研究》的基础上制定的。期间参考了大量国内外相关文献，通过多次实验和反复论证，吸收借鉴国内外相关经验，在遵循标准科学性、实用性和可操作性的原则基础上，确定了燕窝产品真伪鉴定的实时荧光PCR和双向电泳检测方法标准。四、国内外文献调研情况目前燕窝的鉴定方法很多，如表面特征、溶涨性、泡沫、染色、灼烧等简单的物理方法，微观形态的显微观察方法，蛋白质含量、紫外吸收、氨基酸组成、唾液酸含量、多糖组分等仪器分析方法。但上述方法存在一些缺陷，例如燕窝是唾液腺的分泌物,不存在明显的组织细胞特征,因此显微鉴别的结果可靠性不高；燕窝理化鉴别的物质基础在于其粘蛋白,虽有一定的特异性,但由于伪品在制造过程中往往加入一定量的蛋清做粘合剂,故理化鉴别专属性不强；红外光谱法存在样品取样均匀性问题；气相色谱法是以寡糖链成分为分析基础,形成燕窝的单糖指纹图谱以作鉴别，但在生物合成过程,糖蛋白中的糖链是通过糖基转移酶从核苷酸糖将单糖顺次地装配到已形成的糖链受体上,最终生成的糖链结构不但决定于每个糖基转移酶的专一性,而且也受到肽链结构和形成异头键能力的影响,故糖链的合成过程不是模板化的,可以终止不同阶段,因而糖链结构普遍存在微不均一性。这种微不均一性会影响鉴别结果的可靠性〔1，2，3，4〕。相比于上述方法，电泳鉴定是以燕窝所含水溶性蛋白质为分析基础,已经证明燕窝的蛋白质是燕窝药效的物质基础之一。因此,理论上电泳中蛋白质谱带的位置、显色的深浅可很好地反映燕窝的真伪和质量,但由于燕窝蛋白富含唾液酸,影响其电泳分离效果。本方法采用的双向电泳法，结合了等点聚焦和SDS垂直电泳技术，明显增强了蛋白质分离效果。另外，实时荧光PCR法已被广泛应用与物种鉴定，可用于燕窝制品中燕窝成分的快速检测。五、主要技术内容（一）材料与方法1、样品种类及来源4份燕窝样品（苏普官燕、云南白燕、瓜目官燕、瓜曼官燕）由浙江杭州胡庆余堂保健品有限公司提供，另有5份燕窝样品（白燕盏）由广东检验检疫局技术中心提供。葱、大豆、胡萝卜、黄瓜、鸡、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、银耳等19份样品购自市场。2、主要试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、7cm预制pH4.7-5.9梯度胶条、100×两性电解质（pH4.7-5.9，pH6.3-8.3）、蛋白质纯化试剂盒、水化上样缓冲液、胶条平衡缓冲液I、胶条平衡缓冲液II、低溶点琼脂糖、蛋白质分子量标准、矿物油、DTT、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G250、过硫酸铵等购自美国伯乐生物公司；Nucleospin®食品DNA纯化试剂盒购自香港基因公司；SYBRgreenMasterMix试剂盒购自北京欧比特公司。3、主要仪器设备等电聚焦仪、恒温水浴锅、冷冻离心机、微量移液器、垂直板电泳仪、超声波破碎仪、天平、凝胶成像仪、真空浓缩仪、、冷冻干燥仪、荧光PCR仪。4、DNA提取将样品粉碎，称取40mg样品粉末，按照试剂盒说明书提取核酸DNA提取和纯化，产物溶于50µL水。5、实时荧光PCR采用SYBRgreenMasterMix试剂盒，按照25µL体系配制反应液，其中模板体积5µL。引物及反应参数如表1，2所示。表1检测用引物名称序列目的基因Cfib5’端引物Cfib3’端引物5’-TGAATTGAGCCTGTCGTCTG-3’5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’纤维蛋白原基因NA5’端引物NA3’端引物5’-ATTCGAAAAATCCTGGCCTT-3’5’-CATTGGGGTTTTTGTTCAGG-3’NADH脱氢酶表2实时荧光定性PCR反应循环参数作用时间/s温度/℃去污染12050活化DNA合成酶和预变性60095PCR（40个循环）变性1595延伸6060变性反应（1个循环）变性1595复性2060变性1595最后两个步骤之间升温时间设为最大值6、蛋白质提取将样品充分研磨，称取500mg于50ml离心管中，加10ml水，4℃放置24h，1000×g离心10分钟，吸取800µL上清于1.5ml离心管中，共6管。真空离心浓缩3h，液体缩减至约200µL。使用蛋白纯化试剂盒进行蛋白除盐，冷冻干燥后用300µL上样缓冲液溶解，具体操作是通过超声破碎辅助，用上样缓冲液依次溶解所有6管蛋白。12000×g离心5分钟，取上清进行等点聚焦。每个样品制备两份蛋白上清，同时进行等电聚焦和SDS。7、等电聚焦将IGP胶条于室温放置10分钟，沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入蛋白样品。在槽两端1cm左右不要加样，中间样品液保持连贯，去除气泡。用镊子去除IPG胶条保护层，轻轻将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上，使胶条正极对应于聚焦盘正极。去除气泡。在胶条上覆盖3ml矿物油。盖上盖子，设置等点聚焦程序：水化50V12h，线性250V30min，快速500V30min,线性4000V3h,快速4000V至20000Vh,快速500V任意时间。聚焦结束后，立即进行平衡和第二向SDS电泳，否则将胶条置于水化盘中-20℃保存。8、垂直电泳配制10％聚丙烯酰胺凝胶（7cm×7cm）。将聚焦好的IPG胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，另将一份滤纸用水浸湿，直接置于胶条上，吸干胶条上矿物油和多余样品。将胶条放置于水化盘中，加入2ml平衡缓冲液I，缓慢摇15min，取出胶条，竖立在滤纸上去除多余液体，将胶条放置于水化盘中干净的槽中，加入平衡缓冲液II，摇15min,同法吸取胶条上多余液体，将胶条胶面朝上放在聚丙烯酰胺凝胶的长玻璃板上，用少量热的低溶点琼脂糖封胶液滴在玻璃板上，同时使用镊子，轻轻将胶条推入凝胶胶面，不要在胶条下放产生气泡。同时在分子量孔中加蛋白质分子量标准品。用封胶液封闭胶条。凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。加电泳缓冲液，进行电泳，电压设置为50V30min，100V3h，至溴酚蓝指示剂到达底部。9、染色与成像电泳结束后，轻轻撬开玻璃，取出凝胶，用固定液固定2h，再用染色液染色3h，用脱色液脱色至背景干净。用凝胶成像仪成像。使用双向电泳图像分析软件将图谱转换成高斯图谱。（二）实验结果1.实时荧光PCR法特异性M1M1234567图1.不同提取法DNA的Cfib扩增结果MDNA分子量标准（从上至下为600，500，400，300，200，100bp）1，2.CTAB法；3，4PromegaWizard试剂盒法；5，6Nucleospin试剂盒法；7.空白对照。针对燕窝纤维蛋白原基因和NADH脱氢酶基因分别设计引物，通过筛选得到Cfib和NA体系。如图2，3所示，两个引物均显示良好特异性，而且双引物的应用有助于提高检测准确性。由于燕窝产地不同，品种不同，因此需要对不同产地来源燕窝样品检查引物的涵盖范围。如图4，5所示，两个引物对9个燕窝样品均得到Tm值一致的信号峰。图2NADH脱氢酶引物NA体系溶解曲线特异性箭头指示燕窝DNA，其余信号峰来自葱、大豆、胡萝卜、黄瓜、鸡、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、银耳等19种样品。图3纤维蛋白原基因引物Cfib体系溶解曲线特异性箭头指示燕窝DNA，其余信号峰来自葱、大豆、胡萝卜、黄瓜、鸡、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、银耳等18种样品。图49个不同产地燕窝样品的NA体系溶解曲线图59个不同产地燕窝样品的Cfib体系溶解曲线实时荧光PCR法灵敏度图6是Cfib体系的灵敏度实验结果，可检测到0.5％的燕窝/银耳混合物。NA体系具有相同的灵敏度。图6Cfib体系的灵敏度箭头指示0.5％燕窝/银耳混合物3.燕窝双向电泳图谱特征图7是9份燕窝标准样品的双向电泳图谱。图8是最常见的掺假物银耳和燕窝混合物的双向电泳图谱。燕窝图谱的特征包括1)蛋白点为集中分布在图谱中央位置的2-4行平行的蛋白点群（椭圆形和方形标识的模式）；2)蛋白点分子量集中在41KD-28KD；3)蛋白点等电点基本位于4.7-5.9中间以及偏酸位置。银耳燕窝混合物图谱显示含50％银耳的样品能明显检测到掺假物蛋白（虚线标识），20％的样品图谱中掺假物蛋白较弱，但尚能识别。因此，本法对银耳的检测灵敏度可达到20％。另外，应当看出，不同产地和不同等级燕窝的图谱有一些差异，主要表现为蛋白点的深浅，数量，等电点方面，反映了不同品种金丝燕的生物属性的差异以及环境和制备方法导致的燕窝品质的差别，但由于不同燕窝样品的图谱都具有明显的共同特征，因此局部的差别不仅不会对真假燕窝的判断带来影响，而且为不同产地和不同等级燕窝之间的鉴别提供了丰富的信息。图7燕窝标准样品双向电泳图谱M蛋白分子量标准从上至下为：194KD、104KD、57KD、41KD、28KD、21KD、16KD。5.9PI4.75.9PI4.75.9PI4.75.9PI4.7图8银耳与苏普官燕混合物的电泳图谱M蛋白分子量标准从上至下为：194KD、104KD、57KD、41KD、28KD、21KD、16KD。实线为燕窝蛋白，虚线为银耳蛋白。4、双向电泳方法的重现性双向电泳图谱的重现性对本方法的实用性至关重要。我们对一个燕窝标准样品分别进行了三次蛋白质提取和双向电泳实验。结果如图9所示，A,B,C三个图谱的样品量依次为50mg,80mg,100mg。三个图谱重现性良好，蛋白点着色强度随样品量增加而增加。图9燕窝标准样品双向电泳图谱重现性A.50mg样品B.80mg样品C.100mg样品M蛋白分子量标准从上至下为：194KD、104KD、57KD、41KD、28KD、21KD、16KD。六、结论本方法采用实时荧光PCR法进行燕窝成分检测，显示引物特异性、涵盖范围、灵敏度均满足要求，可作为燕窝制品中燕窝成分快速筛查方法；采用双向电泳法对燕窝制品进行真伪鉴别，结果显示燕窝双向电泳图谱特征明显，与掺假物图谱差异显