《奶牛活体采卵技术规程》（征求意见稿）

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB61Technicalspecificationofovumpick-upindairycattle陕西省市场监督管理局发布1DBXX/XXXXX—XXXX本文件依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由陕西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：西北农林科技大学、杨凌秾福农牧科技服务有限公司、陕西省畜牧产业试验示范本文件主要起草人：林鹏飞、靳亚平、王勇胜、肖劲邦、李赫强、谢成运、田满园、王炳科、肖红年、贾永宏。2DBXX/XXXXX—XXXX奶牛活体采卵技术规程本文件规定了奶牛活体采卵技术中采卵室的基本要求、供体牛筛选与饲养管理、供体牛卵巢刺激前评估、供体牛卵巢刺激程序、活体采卵操作、卵母细胞分级鉴定的技术要求。本文件适用于奶牛活体采卵技术及其他相关领域的科研需求。2规范性引用文件本标准采用下列术语和定义下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T26938-2011牛胚胎生产技术规程。T/DACS002-2021荷斯坦牛体型鉴定操作技术规范。3术语和定义3.1供体牛donor指提供优质卵母细胞的良种母牛。3.2活体采卵ovumpick-up（OPU）借助专用兽用超声诊断仪，用阴道探头、采卵针、连接系统和负压泵直接从活体供体牛卵巢上抽吸卵泡液中包含未成熟卵母细胞的操作过程。3.3卵巢刺激superstimulationOPU前，通过专用兽用超声诊断仪和外源性激素，诱导供体牛卵巢发育更多卵泡，确保卵母细胞质量和适宜大小卵泡的比例，配合后续不同体外胚胎生产的操作方法。卵巢刺激与超数排卵不同，后者需诱导卵泡成功排卵，前者应尽可能保证卵泡以适宜大小存在于卵巢上并避免过度成熟。4采卵室基本要求4.1仪器3DBXX/XXXXX—XXXXOPU兽用超声诊断仪：包括显示器、OPU专用阴道探头（128阵元、频率5.5Hz～7.5Hz、适配各型号采卵针）、负压泵（吸引压力0kPa～25kPa、0mmHg～200mmHg恒温器（操作控温范围为适配收集管为50mL离心管）、血糖血酮仪。4.2场地设施采卵室要求清洁安静、明亮宽敞、温度需8℃~25℃,配备有水电、置物台及设置有防踢链的六柱栏保定架。4.3药品耗材所用药品生产厂家应具备生产资质，试剂批号、编号须清晰，试剂和药物应在保质期内并严格按照使用说明书贮存、取用和配置。a)药品。兽用注射用促卵泡素（FSH）、注射用前列腺素F2α、孕酮阴道栓，血糖血酮仪试纸、2%盐酸利多卡因、耦合剂、75%酒精、石蜡油、生理盐水、新洁尔灭等。b)耗材。一次性采卵针（18G×24/5或1,2×70mm）、硅胶管（1.2mm×2.4m20mL、50mL），长臂手套、乳胶手套、口罩、吸水卫生纸等。5供体牛筛选与饲养管理5.1选拔适用对象青年母奶牛和成年母奶牛均可作为候选供体牛群体。选择供体牛时，宜根据牧场育种目标、实际生产需要和基因组测序结果，选择具有产奶量、长寿性、繁殖性能、健康度、适应性和抗逆性等优良遗传学价值的母牛。5.2生产性能分析调取牧场DHI检测、生产性能和繁殖、疾病治疗等记录。供体牛应满足下列要求：a)健康状况良好，排除遗传性疾病与生殖器官疾病；b)年产奶量14t以上，生产寿命高于4胎次；c)成年母牛应为2～4胎次、产后天数超过45d、卵巢机能已完全恢复；d)青年母牛应为9月龄以上、卵巢状态发育良好并至少有1次完整的发情周期。5.3线性鉴定参照T/DACS002-2021鉴定供体牛体型。荷斯坦奶牛共划分5个部位：包括体躯容量（18%）、尻部（10%）、肢蹄（20%）、泌乳系统（42%）和乳用特征（10%），20个线性评分性状和23个缺陷性状。按体型鉴定得分划分为6个等级：优秀（EX，90～100）、很好（VG，85～89）、好+（G+，80～84）、好（G，75～79）、一般（F，65～74）和差（P，65分以下）。应选择等级为“好+”及以上、无明显体型缺陷的母牛作为供体牛。5.4全基因组选择全基因组测序应由商业化公司完成。操作人员应穿戴防护、确保血斑卡干净无污染，奶牛耳号、血斑卡号和表格登录号必须保持一致，规范制作测序血液样本血斑卡：4DBXX/XXXXX—XXXXa)在空白的血斑卡背面标记牛号等信息，用5mL或10mL的一次性无菌注射器，从奶牛尾根部或颈部采集血液样本1mL，立即将血样滴加至血斑卡中心黑色圆圈内，完全覆盖但不能超卡b)放置桌面自然晾干（约12h）。5.5供体牛饲养确认供体牛后，宜单独分群饲养。牧场实施常规管理，日粮配方平衡全面，保持合适体况，环境清洁安静，饲养密度合理，运动适量。应建立和实施完善的防疫、生物安全制度，保证牛群无中毒风险。6卵巢刺激前评估卵巢刺激程序前1天，应评估供体牛是否适合卵巢刺激和OPU操作。a)临床检查。检查供体牛体温、精神状态、采食情况、瘤胃充盈度和粪便等情况，应重点检查是否发生乳房炎、子宫炎、肺炎和腹泻等炎性疾病。b)能量平衡状态检查。检查供体牛近1周产奶量、评估近1天采食状况，卵巢刺激前1天，采集血液样本，检测血糖和血β羟基丁酸水平。其中血糖值应为2.8mmol/L～4.5mmol/L，血β羟基丁酸应＜1.2mmol/L。c)温顺度评估。用牛毛刷评价供体牛温顺度：待奶牛处于颈夹时，用专用毛刷刺激其颈部、背部和尾根部，根据牛只反应评分：1分，奶牛无明显反应；2分，奶牛轻微不安，躲避毛刷，但无攻击性；3分，奶牛明显不安，且表现攻击性。供体牛应性格温顺，易接近、易驱赶，对操作人员无明显攻击性，对注射操作无过激反应。应优先选择评分为1分的奶牛，慎重选择评分为2分的奶牛，尽量不选择评分为3分的奶牛。7卵巢刺激7.1消除卵泡7.1.1程序启动时间。OPU供体牛筛选评估合格后，无需观察或确定发情周期，选定任意一天即可启动卵巢刺激程序。宜在下午启动，减少夜间注射FSH次数并将采卵时间安排在上午。7.1.2供体牛保定。供体牛实施颈夹保定。7.1.3供体牛麻醉。一般情况不需麻醉。如供体牛烦躁不安、左右摇摆、直肠紧绷或努责，可于尾椎和荐椎结合处或第一和第二尾椎结合处注射2.5mL2%盐酸利多卡因实施硬膜外腔麻醉。7.1.4仪器准备。按照仪器操作说明，将硅胶管一端紧密连接一次性采卵针，保持采卵针头无菌置入OPU专用阴道探头针槽中，另一端连接负压泵或一次性50mL注射器。负压泵的负压值应为60mmHg~110mmHg（或流速为20mL/min～30mL/min）。7.1.5供体牛清洁消毒。刺激排粪或掏尽供体牛积粪，用0.1%新洁尔灭仔细清洗供体牛会阴处和外阴，并使用75%酒精消毒。7.1.6超声检查。将连接好的OPU超声诊断仪阴道探头插入供体牛阴道，一手固定保持位置，另一手佩戴长臂手套伸入供体牛直肠，通过直肠把握卵巢，动作轻柔、双手配合将卵巢间隔阴道穹隆贴于超声探头上。显示器屏幕能清晰显示卵巢状态时，记录卵巢状态：有无黄体及其大小，2mm～5mm的卵泡数量，5mm以上的卵泡数量及卵巢囊肿或粘连等异常情况。采取同样方式检查并记录另一侧卵巢。5DBXX/XXXXX—XXXX7.1.7抽吸消除卵泡。由专业人员参照显示影像引导线，控制一次性采卵针刺入卵巢，抽吸全部＞5mm卵泡，应抽尽并避免出血，抽吸的卵泡液可弃掉，每头供体牛抽取5mm以上卵泡不超过5个。7.1.8仪器清洗。对下一头供体牛操作前，应用0.1%新洁尔灭清洗阴道探头，更换一次性采卵针，避免交叉感染。7.2溶解黄体消除卵泡24h后，对存在黄体的供体牛肌肉注射单剂量PGF2α。以商品谛诺为例，注射5mL。无黄体的供体牛，省略此步骤。7.3FSH刺激消除卵泡36h后，根据药物说明书溶解或直接肌肉注射第1针FSH（注射剂量为167国际单位），随后每间隔12h注射167国际单位FSH一次，共注射三次，总剂量500国际单位。7.4选择性放置孕酮阴道栓第1针FSH注射后，可选择性放置孕酮阴道栓直至OPU前取出。7.5滑行期第3针FSH注射完成后，不做任何处理，24h后实施OPU。7.6程序总览供体牛卵巢刺激程序共应操作4～5次，总时长84h（3.5d），操作时间误差不超过±1h。保证OPU时可采集卵泡超过25个，且适宜大小卵泡（5mm～8mm）占比75%以上，可用卵母细胞（A级、B级和C级卵母细胞）占比90%以上。图1供体牛卵巢刺激程序6DBXX/XXXXX—XXXX图2卵巢刺激程序实施后效果8OPU操作8.1供体牛保定将供体牛无应激赶至牛活体采卵室，用六柱栏保定架牢固保定，设置好防踢链子。8.2供体牛麻醉应先掏去直肠内积粪，再于尾椎和荐椎结合处或第一和第二尾椎结合处注射5mL2%盐酸利多卡因做硬膜外腔麻醉。8.3仪器准备按照操作说明连接兽用OPU超声诊断仪。将硅胶管一端紧密连接一次性采卵针（17G×600mm长针或18G短针）并保持针头无菌，置入OPU专用阴道探头的针槽中。另一端通过采卵收集管（50mL离心管）连接负压泵，采卵收集管内提前加入5mL左右预热好的卵母细胞保存液，负压值设置为60mmHg~110mmHg（或流速为20mL/min～30mL/min），恒温箱温度设定为38℃±1℃。8.4牛清洁消毒用0.1%新洁尔灭仔细清洗供体牛会阴处和外阴，并使用75%酒精消毒。8.5OPU操作将连接好的兽用OPU超声诊断仪阴道探头插入供体奶牛阴道内，一手固定保持位置，另一手佩戴长臂手套伸入供体奶牛直肠，通过直肠把握卵巢，应动作轻柔、双手配合将卵巢间隔阴道穹隆贴于超声探头上，显示器能清晰显示卵巢状态时，调整探头与卵巢的相对位置，选择清晰可见的卵泡（大于2mm推进采卵针，刺破卵泡壁时用开关控制负压泵抽吸卵泡内容物至收集管中，记录穿刺卵泡数量。采用同样方法对另一侧卵巢进行采集。8.6冲洗管道待所有清晰可见的卵泡均被穿刺后，用采卵液冲洗采卵针和导管，连同冲洗液一同置于收集管中；迅速运送至实验室。操作过程应保证温度恒定。7DBXX/XXXXX—XXXX9卵母细胞分级鉴定9.1冲洗过滤使用20mL注射器将采集到的卵泡液缓慢加入集卵杯上方滤网中，盖上盖子倾斜过滤，随后用38.5℃预热的卵母细胞洗涤液润洗收集管的管壁、盖子和集卵杯盖2～3次。多次用卵母细胞洗涤液缓慢冲洗集卵杯滤网四周直至采卵液清亮。9.2卵母细胞收集在体视显微镜下，用检胚管检出卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合物（COCs）。检出时应尽量少携带液体，降低污染。9.3洗卵检出的COCs放入不同hepes中润洗3～5次；在OM洗液中润洗3～5次；在体外成熟液中润洗1次后移到IVM卵滴中，置于三气培养箱成熟