2025版高考生物二轮复习课件 第一部分 专题九 争分点突破2 基因工程

基因工程争分点突破2

一

核心提炼1.限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。2.基因表达载体的构建过程(如图)3.Cre/LoxP重组酶系统(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。(3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。4.CRISPR/Cas9基因编辑CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。5.In－Fusion技术In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。判断下列关于基因表达载体构建的叙述(1)基因表达载体上的启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，而终止子是使翻译过程在需要的地方停下来(

)提示：基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录；终止子使转录过程在所需要的地方停下来。×(2)基因表达载体具有多个限制酶切点，有助于目的基因的表达，而复制原点的作用是保证标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存(

)提示：载体具有多个限制酶切点，以便构建基因表达载体；复制原点可以保证重组DNA分子在受体细胞中能自我复制。×(3)在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟(

)(4)利用蛋白质工程技术在腈水合酶(N0)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现(

)√√(5)“DNA粗提取与鉴定”实验中，在DNA溶液中加入二苯胺试剂后即呈现蓝色(

)提示：将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热五分钟，待冷却后，溶液呈现蓝色。×(6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀(

)提示：“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速细胞碎片的沉淀。×(7)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(

)×提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。二

真题演练1.(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在_____________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是_______________。避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化T4DNA连接酶2.(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是____________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是___________________________________________________________________。终止子启动子RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA

鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来3.(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。

正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)4.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：(1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是__________________________________________________________________________。磷酸二酯键

不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。C－G、A－T、U－A5.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。(1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中_________的诱导作用最强。HindⅢ、BamHⅠ交链格孢根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。(2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：_____________________________________________________________________。利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。6.(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则：(1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________________________________________

农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起___________________________________________________。(2)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是______________________________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是___________________________，依据是____________________________________________________________________________________。荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根观察幼苗是否表现出白化特征致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除PDS缺失会导三

模拟预测1.研究人员将靛蓝色素酶基因(IDG)与启动子PTL12(棉纤维细胞特异启动子)相连以构建基因表达载体(如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点)，并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是______________________________________________________________________________________________。PTL12是棉纤维细胞特异启动子，将IDG与特异启动子PTL12结合可以使IDG基因在棉纤维细胞中特异表达过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是__________________________________________________________________________________。形成相同的黏性末端，使PTL12片段能与IDG按设计方向正确连接，保证IDG的正确表达2.(2024·天津宁河区高三一模)蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2，从而提高细胞光合速率。我国科学家构建了叶片特异性启动子Cab(叶绿体捕光色素蛋白Cab基因启动子)驱动的蓝细菌ictB基因表达载体，并通过农杆菌转化法获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：(1)为使重组DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端添加的序列所对应的限制酶是________，N端添加的序列所对应的限制酶是________。添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要______种酶。Bgl

ⅠEcoRⅤ4据图1可知，重组DNA分子中有BamHⅠ的酶切位点，故不能选择BamHⅠ，又因为Sau3AⅠ也可识别BamHⅠ的酶切位点，故也不能选择Sau3AⅠ，又由于Spe

Ⅰ能切割Cab启动子，也不能选择，故只能选择Bgl

Ⅰ和EcoRⅤ，再根据启动子的方向可知，M端添加的序列所对应的限制酶是Bgl

Ⅰ，N端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅤ；添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要4种酶，分别是Bgl

Ⅰ、EcoRⅤ、DNA连接酶和Sau3AⅠ(切割Ti质粒)。_____________________________________。检测应选用的植物器官是______，原因是_________________________________________________________________。(2)将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入________进行筛选，最终获得多个水稻株系a1、a2、a3、a4。对a1～a4四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2，其中a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是_________潮霉素a4水稻株叶片系中没有导入目的基因或目的基因未表达Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达由图1可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T－DNA上，随T－DNA整合到水稻细胞的染色体上，所以将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可再分化形成丛芽，最终获得多个转基因水稻株系；蛋白质的表达量与基因的表达有关，故a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是其没有导入目的基因或目的基因没有表达。由于Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达，故检测应选用的植物器官是叶片。3.随着土壤盐渍化(主要是Na＋引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K＋可维持细胞内K＋/Na＋稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K＋转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP－B和YFP－H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP－B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300－CFP。相关信息如图所示。请回答下列问题：(1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是___________________________________________________________________________________。BamHⅠ和Pst

ⅠBsrGⅠ在CFP基因中存在，不能使用；双酶切可避免目的基因和载体自身环化和反向连接(2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是___________________________________________________________________。

使得CFP与B基因之间的碱基个数为3的倍数，翻译时B基因不发生移码第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________________________________________。用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。

第一条引物与模板链配对，序列与图示B基因序列相同，第二条引物与非模板链配对，序列应与图示B基因序列互补4.通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。限制酶EcoRⅠBamHⅠHindⅢXma

Ⅰ识别序列和切割位点↓5′—GAATTC—3′

↓5′—GGATCC—3′

↓5′—AAGCTT—3′

↓5′—CCCGGG—3′回答下列问题：(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是_____________________________。无需使用限制酶和DNA连接酶(2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。(3)图2过程⑦中，在含有_______________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加______________。EcoRⅠBamHⅠLacZ四环素和X－gal蔗糖和X－gal5.PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题：(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生____个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________________________________。2定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合(2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是_________________________________________________________________________________________________。既能专一性切除多余的PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠(3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列__________________和__________________，保证DNA片段定向插入。②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是_________。5′－GTCGAC－3′5′－GGATCC－3′Cas9基因为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加Sal

Ⅰ的识别序列；由于Xho

Ⅰ与Sal

Ⅰ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamHⅠ的识别序列。6.(2024·青岛高三二模)某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育系的思路是将育性恢复基因OsNP1(在原始生殖细胞中表达)、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表达)两个基因一起构建重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合但两个转基因位点是杂合的可育植株。(1)图1为已导入ZM－AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNP1基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有_____________________________；采用PCR技术扩增图2中的OsNP1基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNP1基因在第n次循环中新合成的短链数为_______。BamHⅠ、HindⅢ和DNA连接酶2n－2图1重组Ti质粒的启动子和终止子之间含有三种酶的酶切位点，即EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ，而图2OsNP1基因两端的酶切位点为EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ，EcoRⅠ酶切会导致目的基因和Ti质粒自身环化和反向连接，为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶是BamHⅠ、HindⅢ和DNA连接酶。PCR技术扩增会出现长、中、短三种长度的单链，分别代表模板链、引物链(第一次扩增形成的)、新合成的短链；一个OsNP1基因在n－1次循环中共形成2n－1个DNA分子、形成2n个DNA单链，而这些单链中只有模板链不会新合成短链，则第n次循环中新合成短链的数目＝2n－2。(2)重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是_________________________________、_______________________________。筛选出导入目的基因的愈伤组织细胞筛选出导入重组Ti质粒的农杆菌新霉素抗性基因作为标记基因，用于筛选含有目的基因的受体细胞(愈伤组织细胞)；卡那霉素抗性基因作为选择标记基因，用于筛选含有重组Ti质粒的农杆菌。(3)若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与_____________________________________________重组在一起。在特定细胞中特异性表达的基因启动子等调控元件四

专题强化练12345678910111213答案对一对题号12345678910答案ADACCBCABCACDBD题号11答案(1)低256(或44)

GTTT

CAAT(或CAAT

GTTT)

(2)卡那霉素SacⅠ

④

(3)1/412345678910111213对一对题号

12答案(1)Cla

Ⅰ

Mun

Ⅰ

(2)4

P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO题号13答案(1)DNA聚合酶和DNA连接酶引物F13′端序列(2)BclⅠ和SmaⅠ

①④

(3)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞(4)根促进植物对磷元素的吸收答案1.(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是A.图示表明，可以从酿酒酵母S

中分离得到目的基因gadBB.E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，

L-谷氨酸钠的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒√12345678910111213答案由图示可知，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；由题干可知，E.coliB以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸，因此L-谷氨酸钠为反应底物，而不是起供能作用，B错误；E.coli

A和E.coliB均为生产γ-氨基丁酸的菌种，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；根据题干及题图给出的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。12345678910111213答案2.(2024·永州高三模拟)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花出现的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建了基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法将上述基因导入白玫瑰，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述正确的是A.不同限制酶的识别序列都是由6个脱

氧核苷酸组成的B.将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制

酶是SpeⅠ和BamHⅠC.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和SacⅠD.启动子和终止子不表达出蛋白质，都属于基因的调控序列√12345678910111213答案大多数限制酶的识别序列由6个脱氧核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的脱氧核苷酸组成，A错误；由图可以看出，idgS基因插入Ti质粒的SpeⅠ和SacⅠ两个限制酶识别位点之间，sfp基因插入Ti质粒的启动子1和终止子1之间；将sfp基因插入Ti质粒时，可使用限制酶BamHⅠ，将idgS基因插入Ti质粒时，可用SpeⅠ和SacⅠ进行双酶切割，B、C错误；启动子和终止子不表达出蛋白质，都属于基因的调控序列，D正确。12345678910111213答案3.由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是A.构建重组载体P时，应选择EcoRⅤ进

行酶切，再用T4DNA连接酶连接B.为了便于该目的基因接入载体E，可

用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体PC.载体P不能作为基因表达载体，是因

为它不含起始密码子和终止密码子D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞√12345678910111213答案由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割产生平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端用T4DNA连接酶，A正确，B错误；12345678910111213答案由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。12345678910111213答案4.目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是A.PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链

形成双链B.电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和

构象有关C.选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接D.选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接12345678910111213答案√复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；12345678910111213答案由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管目的基因正接还是反接，扩增出的片段均为450bp，C错误；选取引物甲和乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp的片段，D正确。12345678910111213答案5.普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接)，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，图中SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ代表相应的酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3kb、18kb、28kb、59kb4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是A.正义GhMnaA2基因的转录方向是B→AB.过程①得到的表达载体均为反义表达载体C.反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2

基因的翻译来保证棉纤维长度D.用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段

的长度为21kb和87kb√12345678910111213答案由图可知，反义表达载体中，反义GhMnaA2基因转录方向是B→A，则正义GhMnaA2基因的转录方向是A→B，A错误；由于只能由SmaⅠ来构建反义表达载体，因此过程①得到的表达载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；12345678910111213答案反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；12345678910111213答案用SmaⅠ和NotⅠ切割正义表达载体可获得3kb、18kb、28kb、59kb4种长度的DNA片段，据此判断左侧SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是59kb，A位置处SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是3kb，B位置处SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是18kb，右上角E6位置处SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是28kb，故用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D错误。12345678910111213答案6.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了图示表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是A.可用农杆菌转化法将构建好

的表达载体导入植物细胞B.为连入GUS基因，需用SalⅠ

和SphⅠ酶切已整合了双向

启动子及LUC基因的质粒C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入该表达载体的微生物受体细胞D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用√12345678910111213答案将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。12345678910111213答案7.(2024·常德高三三模)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是A.将目的基因插入质粒中时，需要用到的

酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶B.需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一

种能吸收周围环境中DNA分子的状态C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌

后，大肠杆菌可正常表达该目的基因D.在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落12345678910111213答案√目的基因两侧含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的识别序列，将目的基因插入质粒中时，需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起，A正确；将目的基因导入受体细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，B正确；12345678910111213答案将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，D正确。12345678910111213答案8.(不定项)(2024·德州高三二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法正确的是12345678910111213答案12345678910111213答案A.CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关B.基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱C.两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达D.据图2可知，用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好√√√CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关，即主要与sgRNA序列的特异性相关，A正确；猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高了器官移植的成功率，B正确；12345678910111213答案转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于驱动基因的转录，科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；12345678910111213答案据图2可知，与对照组相比，用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达量更低，说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。12345678910111213答案9.(不定项)(2024·永州高三一模)Cre/LoxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法正确的是A.Cre酶切下一个待敲除基因的过程，

需要破坏四个磷酸二酯键B.若小鼠细胞含一个表达载体T(不含

Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色C.若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色D.若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其一个脑组织细胞内可能随机出现两种颜色√12345678910111213答案√√12345678910111213答案DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；12345678910111213答案小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能随机出现两种颜色，D正确。10.(不定项)(2024·青岛高三二模)TaIBH1－2D是小麦中一个调控千粒重的关键基因。为验证TaIBH1－2D的功能，研究人员构建了过表达株系，可利用酶切法检验TaIBH1－2D与载体是否连接，图1三个泳道分别是用不同的限制酶完全酶切后(只考虑图示酶切位点)，产物经琼脂糖凝胶电泳的结果；同时构建了敲除TaIBH1－2D基因的突变体。图2统计了不同植株的千粒重。下列说法正确的是12345678910111213答案A.电泳的缓冲液中含指示剂，可在紫外灯下被检测出来B.泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体C.泳道3为双酶切的重组载体，且目的基因与载体正确连接D.由图2分析，TaIBH1－2D负调控小麦千粒重√12345678910111213答案√载样缓冲液中的指示剂指示电泳进程，核酸染料加在凝胶中，凝胶中的DNA分子经过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，A错误；12345678910111213答案泳道1和泳道2均出现一个条带，说明这两个条带都是单酶切得到的，因为重组载体单酶切后的长度大于空载体，泳道1的条带长度小于泳道2，则泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体，B正确；12345678910111213答案泳道3有一个条带的大小与泳道1相同，且还有两个较小的条带，则泳道3为限制酶A和限制酶B双酶切的重组载体，由于目的基因的两侧都有限制酶A的酶切位点，所以无法判断目的基因与载体是否正确连接，C错误；12345678910111213答案分析图2，TaIBH1－2D基因过表达株系的千粒重小于野生型和敲除突变体的，说明TaIBH1－2D负调控小麦千粒重，D正确。12345678910111213答案11.(2024·山东，25)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。12345678910111213答案LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr氨苄青霉素抗性基因。甲载体信息12345678910111213答案乙目标基因L部分序列丙限制酶识别序列、切割位点及电泳结果(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有_________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－______________－3′和5′－______________－3′。12345678910111213答案低256(或44)GTTT(或CAAT)CAAT(或GTTT)单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任意碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′到3′。12345678910111213答案12345678910111213答案(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_______，其中纯合的突变植株是______(填序号)。卡那霉素SacⅠ④导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，12345678910111213答案根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。12345678910111213答案(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为_____，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。12345678910111213答案1/4根据题意可知，在实验中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测却发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T－DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T－DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。12345678910111213答案12.(2024·岳阳高三期末)人促红细胞生成素(EPO)是一种可用于治疗肾性贫血的糖蛋白类激素，可用乳腺生物反应器生产EPO。科研人员利用大12345678910111213答案鼠乳清酸蛋白(WAP)基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列构建了基因表达载体。构建前，科研人员扩增了WAP基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入EPO基因中，以确定WAP基因启动子的具体位置。相关信息如图所示，回答下列问题：12345678910111213答案(1)为将扩增后的产物定向插入基因表达载体中，以指导EPO基因的表达，需要在引物末端添加特定的限制酶识别序列。由图中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是______，在A末端添加的序列所对应的限制酶是_______。ClaⅠMunⅠ需要将WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列与EPO基因相连，则扩增的WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位点，则P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是ClaⅠ，WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的3′端需要与EPO基因相连，但是不能破坏EPO基因序列，也不能破坏WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，则A末端添加的序列所对应的限制酶是MunⅠ。12345678910111213答案有EPO生成。含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成的原因是___________________________________________________________。12345678910111213答案(2)将通过PCR处理后的含不同长度的WAP基因上游序列与EPO基因连接，构建成表达载体的过程中，需要____种限制酶切割上述DNA片段。检测转基因雌性大鼠时发现，导入含P1～P3与A扩增产物的个体乳汁中有EPO，而含P4与A扩增产物的个体没4P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达需要用两种限制酶切割WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，用两种限制酶切割EPO基因，所以共需要4种限制酶切割上述DNA片段。P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达，则含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。12345678910111213答案(3)该实验中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子的理由是___________________________________________。能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达12345678910111213答案启动子具有组织特异性，大鼠WA