2025版高考生物二轮复习课件 第一部分 专题九 争分点突破1 PCR技术与应用

PCR技术与应用争分点突破

1一

核心提炼二

典例突破一、PCR技术“引物”归类分析1.引物的设计(1)(2020·山东，25节选)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是_______________________________________________________________________________。引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(2)(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。碱基互补配对G、C含量高(3)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是_______________________________________________________________。若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)引物过短导致引物的特异性下降拓展

引物与复性温度(1)复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。(2)引物：①引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；②引物GC含量越高，容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。2.引物的修饰(1)(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸5′端引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是__________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoR

Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________。P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的在第一次PCR循环结束后，得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在以后的PCR循环中，以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增，实验结束得到的绝大部分DNA片段是选项中的D。√3.引物的结合方向如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：扩增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________________；______________________________。5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′5′-TGATCTACGGCTTACA-3′书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。4.引物的选择(2023·山东，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。F1和R2(或F2和R1)a链据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(2)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。J－V5融合蛋白不是重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。5.引物的数量计算(1)如图：一个DNA分子n次扩增，则：①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为________个；②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为_____个；③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为_____个；④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个；⑤复制过程中共需引物________个；⑥第n次复制需要引物______个。2n－2n2n22n－12n＋1－22n(2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。2二、PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来√琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是__________________。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相三、常用PCR技术及原理1.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式目的基乙和丙因反向连接如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400bp片段。2.利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说法不正确的是A.PCR1所用引物应为引物A和BB.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板C.PCR3无需额外加入引物D.PCR4的作用是大量扩增突变基因√引物与模板的3′端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B，A正确；由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误；由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确；PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。3.利用重叠延伸PCR技术构造融合基因融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题：(1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。2互补配对分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。86图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。(3)图2中需使用______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。Spe

Ⅰ、Sal

Ⅰ复制原点图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe

Ⅰ和Sal

Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe

Ⅰ和Sal

Ⅰ的识别位点，因此图2中需使用Spe

Ⅰ、Sal

Ⅰ和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。4.利用反向PCR技术扩增未知基因序列如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)。请据图回答问题：(1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。名称DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列5′-AACTATGCGCTCATGA－－－－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′3′-TTGATACGCGAGTACT－－－－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′②④由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用TaqDNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′，可根据已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，设计对应PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，(2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′B对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。5.实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸

基团B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的

核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman

探针C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新

链的合成提供能量D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循

环数越少，说明含有的病变的概率越小√DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确；做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误；在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。6.“双脱氧法”基因测序(不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的

一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G√√利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B错误；根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′-CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。(4)双脱氧法原理示意图：三

专题强化练1234567891011答案对一对题号12345678910答案DBADCDDABCABCABD题号11答案(1)PCR扩增时未在引物上将S基因编码终止密码子的TGA删除，导致融合基因翻译提前终止，未表达出HA的氨基酸序列HA编码序列的第一个碱基与HA编码序列前的载体的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致HA的mRNA的密码子被错误读取(2)R蛋白对S蛋白和N蛋白去磷酸化SPD可促进R蛋白的表达(3)一方面，SPD通过促进R蛋白表达，对N蛋白去磷酸化后间接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖；另一方面，SPD通过促进R蛋白表达对S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，从而抑制癌细胞增殖1.(2024·长沙高三模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是A.图中两条子链合成一定都是从5′端

向3′端延伸B.图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关C.用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物D.PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充√1234567891011答案TaqDNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC碱基含量越高，则复性的温度设置越高，B正确；经过5次循环后会产生25＝32(个)DNA，其中双链不等长的DNA有2×5＝10(个)，因此扩增5次后可以产生32－10＝22(个)目标产物，C正确；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。1234567891011答案2.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是A.①＋③

B.①＋②

C.③＋②

D.③＋④√1234567891011答案若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B符合题意。1234567891011答案3.(2024·盐城高三模拟)关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列相关叙述错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都

必须进行高压灭菌处理B.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热到

熔化，稍冷却后加入核酸染料混匀C.电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂可提示终止时刻D.－20℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化√1234567891011答案PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压灭菌处理，A错误；电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂溴酚蓝迁移速度较快，可提示电泳的终止时刻，C正确；PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，D正确。1234567891011答案DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有A.①②

B.②③

C.①④

D.③④4.(2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链√1234567891011答案制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①试管中的两种单链能错位配对

，但是配对后伸出来的游离的单链是3′末端，因缺乏模板，无法利用原料进行延伸，因此不能得到带有荧光标记的DNA探针，①不符合题意；③试管中的两种单链可以错位局部配对

，配对后伸出来的游离单链是5′端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用碱基被荧光标记的dATP进行延伸的，③符合题意；1234567891011答案②和④试管加的都是1种单链DNA，试管中存在两种可能：一是这条单链的3′端回折与自身一部分碱基配对，从而作为引物和模板，即

，但是配对区只有5个碱基对，即使经过延伸最终只有8个碱基对，与题中“本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”这句话相矛盾；二是加入适量同种单链，2条相同单链之间可以反向互补配对成双链区。对于②试管，配对后：

，配对区大于9个碱基对，但因伸出来的模板链碱基是AGA，导致延伸时碱基被荧光标记的dATP无法掺入到子链合成中去，因此②不符合题意；1234567891011答案对于④试管，配对后：

，配对区大于9个碱基对，且伸出来的模板链碱基是TTC，碱基被荧光标记的dATP必然可以掺入到子链合成中去，④符合题意。综上，故选D。1234567891011答案5.以DNA复制为基础的双脱氧链终止法是最早的基因测序方法，在反应体系中需加入ddNTP(有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP4种，图1)和dNTP(有dATP、dGTP、dCTP、dTTP4种，图2)。当以3′－CCATGCAC－5′为模板测定链中碱基A的位置时，子链复制延伸到第三位碱基A时，若与其配对的原料是ddTTP，则子链延伸终止；若与其配对的原料是dTTP，则子链继续延伸；直到第七位的碱基A时，又会出现以上两种配对的可能，这样就能在一个体系中得出多种长度的子链，再依此类推，可以知道模板链上的其他碱基的位置。图3是以该技术的测序原理得到某DNA的电泳图谱。下列说法不正确的是1234567891011答案A.每个反应体系中应加入相同的模板链、一种

ddNTP和四种dNTPB.ddNTP和dNTP都可脱去两分子磷酸为反应体

系提供能量和原料C.由图3可知复制出的DNA子链的碱基序列是

5′—ATCGCATCAT－3′D.ddNTP的脱氧核糖3′上脱氧导致其无法连接

下一个核苷酸5′上的磷酸基团√1234567891011答案双脱氧链终止法是在相同的模板DNA链中分别加入一种ddNTP和四种dNTP的反应体系中进行，由于模板链相同，复制时DNA子链在进行碱基互补配对到T时，用到了对应的ddATP、dATP，若随机配对上的是ddATP，则该链复制停止，若随机配对上的是dATP，则复制继续进行，直到下一个对应的碱基T又会重新出现上述配对的可能，1234567891011答案这样在一个体系中就会因碱基T的配对而出现多条长短不同的DNA链；依此类推，分别可以测出模板链碱基是A、C、G每个体系下的短链，再进行凝胶电泳分离，最短的链跑得最快，最早合成，而子链的复制是从5′→3′的方向，所以由图3可以读出子链碱基序列从上到下为3′－ATCGCATCAT－5′，总共需要四个体系，分别测出四个碱基的顺序，A正确，C错误；1234567891011答案ddNTP和dNTP同时带有特殊的化学键，且脱去两分子磷酸后可以为DNA复制提供原料，B正确；由图1和图2可知，ddNTP和dNTP的区别在于五碳糖的3号位是否脱氧，ddNTP3号位为－H，无法与下一个脱氧核苷酸的磷酸基团连接，D正确。1234567891011答案6.常见PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是A.酶切阶段，L中不能含有

酶切时所选限制酶的识

别序列B.环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对D.PCR扩增，将温度调至72℃的目的是使引物与模板链结合√1234567891011答案在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶，B正确；1234567891011答案PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；PCR扩增中，将温度调至72℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。1234567891011答案7.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为

单链DNA片段B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮

PCR反应正确性的鉴定C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，

该技术可大大提高扩增的特异性D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物√1234567891011答案两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板链互补配对，A正确；第二轮PCR使内引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；1234567891011答案如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。1234567891011答案8.(不定项)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。图示为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法不正确的是A.引物2的3′端序列应包含XbaⅠ的识别序列B.重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体C.PCR反应时，缓冲液中一般要添加Ca2＋来激

活相关酶D.引物1的5′端序列应考虑将GTG改为ATG√1234567891011答案√√根据题意可知，含GTG的一端为LDH基因的起始端，为保证通过双酶切以正确方向插入质粒，设计引物1的5′端序列需要包含BamHⅠ的识别序列，引物2的5′端序列应包含XbaⅠ的识别序列，A错误；1234567891011答案结合题意可知，质粒上有作为标记基因的尿嘧啶合成酶基因，所以本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上培养，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因可以正常生存，从而起到筛选作用，B错误；1234567891011答案真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋，C错误；设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好地表达，D正确。1234567891011答案9.(不定项)(2024·长沙高三模拟)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法正确的是A.一定范围内，荧光强度与扩增出的

DNA量呈正相关B.每个反应管内荧光探针的量相同C.样品甲的初始模板量大于样品乙D.荧光强度不再变化时PCR反应停止√1234567891011答案√√在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关，A正确；最终各反应管的荧光强度一样，说明每个反应管内添加的荧光探针的量相同，B正确；1234567891011答案PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此DNA数量越多，荧光强度越大，样品甲达到最大荧光强度所用的时间短于乙，因此样品甲的初始模板量大于样品乙，C正确；荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若为前者，此后PCR反应仍在进行，D错误。1234567891011答案10.(不定项)(2024·济南高三一模)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述正确的是A.第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮

PCR复性的温度B.PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子

等结构才能进行转录和翻译C.第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR

所用的引物D.将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程√1234567891011答案√√为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则产物需具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；1234567891011答案除了第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，应使诱变引物中包含ATG或TAC序列，该过程属于蛋白质工程技术范畴，D正确。1234567891011答案11.(2024·滨州高三二模)TGF－β信号通路可通过S蛋白去磷酸化抑制癌细胞增殖，该过程中N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白发生磷酸化。药物SPD可通过影响R蛋白来增强细胞对TGF－β信号通路的响应。为探索药物SPD治疗癌症的机理，需构建基因表达载体以获得融合蛋白S－HA、N－HA和R－HA。HA是一种短肽，连接在S、N或R蛋白的羧基端(不影响S、N或R的功能)，细胞中只有带HA标签的融合蛋白能与介质上的HA抗体结合，从而分离得到HA标签融合蛋白。1234567891011答案(1)用于PCR扩增S基因的引物5′端分别加入了限制酶NheⅠ和HindⅢ的识别序列，将扩增后的S基因插入载体上，构建含S－HA融合基因的表达载体，如图1所示，