DB21T 3120-2019 水产动物物种分子鉴定COI、16S rRNA分子标记法

DB21Technicalspecificationforspeciesmoleculariden辽宁省市场监督管理局发布I1水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法本方法规定了水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法的相关术语试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的本方法适用于水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNAGB/T6682分析实验室用水规格和试验指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分聚合酶链式反应polymerasechainreactio24标记方式比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16SrRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank（/genbank）和BOLDSystem（）两个数实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。——95%乙醇；——TE缓冲液（pH7.6100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0——Taq酶（5U/μL——10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2）；——溴化乙锭（10mg/mL）；）；5.2仪器和设备）；3样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、积3mol/LNaAc和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置于-27.1.412000rpm离心15min，弃上清。以分别于260nm和280nm波长下测定DNA的紫外吸收值。DNA浓度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀释4），），9物种鉴定9.1序列比对鉴定将COI基因序列在GenBank和BOLDSystem中进行核苷酸序列比对，将16SrRNA基因序列在GenBank——若出现2个及以上比对结果，则选取相似度高且结果一致的鉴定物种作为鉴——对于鉴定成功的样本，记录于《水产动物物种分子鉴定记录表》9.2未检出样本未检出样本记录于《未检出水产动物分类记录表5PCR扩增引物F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-F:5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3'R:5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-F:5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-R:5'-ACCAATCATAAAGATATTGF:5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-R:5'-GTAAATATATGRTGGGCTCF:5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-R:5'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAF:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCF:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-F:5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3'R:5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGF:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC纲和头足F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGF:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTATCGF:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTTTCG6鉴定人；地点123456789采样人记录人7鉴定人；地点123456789采样人