企业组织设计组织细胞学观察研究办法讲义

企业组织设计组织细胞学观察研究办法讲义生物显微技术是高等院校生物系各专业的基础课,包含生物材料固定技通过这门课的学习，希望能够帮助大家加强生物实验的技能。使学生掌握制作动、植物显微切片的技术,掌握使用光学显微镜及进行显微摄影所必备本《生物显微技术大实验》是为了配合这门课的教学，在参考了国内一些相关教材的基础上，结合本教研室的历年实验经验与心得而编写的，仅供唐山师范学院生命科学系学生使用。生物显微技术的内容在其他教材中叙述比较零乱，没有统一的整体性。本指导在结合我系教学安排和实验的前提下，有针对性的安排了生物显微技术的理论教授和实验指导。内容由于编者业务水平和工作经验所限，虽然做了大量努力，书中难免还会存在缺点和不足。为此切盼广大师生在使用本书过程中能提出批评和建 4 4 8 10 37 48 48附彩色显微摄影和黑白显微摄影的相关知识 53 57 64实验一徒手切片与整体制片法 66 70 72 78实验四数码显微摄影及研究分析软件的使用 88实验五所作切片的观察照相、提交作业 99（一）生物学实验使用的玻璃器皿及玻片均要清洗干净,应以壁面被水均匀润湿而无水）：配制1M所需溶质的量（ml）硫酸磷酸透明（一）切片法:2.石蜡切片：4-12μm厚，用石蜡浸透到组织中，并①半径切面：以刀穿过中心点与其半径吻合的切面，这种切面可观察到茎中各种核蛋白沉淀后溶于水；醋酸不能凝固胞质蛋白但能凝固核蛋白;福尔马林、锇酸、重铬若长期保存材料与甘油等量混合后使用。70%酒精：甘油=1：1：（锇酸的配制：用重蒸水配成母液2%，使用时，用PH7.0、0.2M磷酸缓冲液稀释一倍到：（配方：纯酒精：冰醋酸=3：1度快，为防止组织硬化，固定时间不要超过24小时。时间以材料的不同而有所区别，2.福尔马林-醋酸-酒精混合液FAA）：（ⅠⅡⅢⅣⅤ冰醋酸蒸馏水④脱水至纯酒精时，需更换两次，每次30min-1h；材料大者，可多换一次。由Ⅲ（ml）Ⅳ（ml）Ⅵ（ml）5000Ⅲ（ml）Ⅳ（ml）Ⅵ（ml）0000变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。以利于切片和观察，这个过程将为“浸蜡”和般动物材料石蜡的熔点为52-56℃,植物材料石蜡的熔点为54-58℃。（3）最重要的要看室内温度，通常在夏天用熔点高的石蜡-硬蜡，冬天用熔点2.将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片1.将展片机温度调整到35℃,保持恒定。玻：（6.材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水纸吸干背面及脂质染色剂：苏丹Ⅲ,苏丹Ⅳ,苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。成酸性或碱性染色剂。如酸性染色剂，能够产生氢离子（H+)或其它阳离子(Na+),而其本身成为带负电荷的阴离子者。这类染色剂一般用于染细胞浆，如一般用于细胞质染色。常用的如伊红，酸性品红，苦味酸，橘黄G，般用于胞核染色。着色能力差，染色时间长。常用的如苏木素,卡红,次甲基蓝,甲苯胺⑧,⑨类染色剂使用极少。）：（1）酸性品红:酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为（9）龙胆紫:龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要microscopehistochemistry)。这种方法可用于检测细胞内的酶类、糖类醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫C反应的强弱与氧化的时间及氧化强度有关。过碘酸的（2）显示总蛋白质的汞-溴酚兰法论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切解时间不够,反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸钠)的溶不论哪个厂家的显微镜，在选择显微摄影用物镜时都要注意此点。消色差物镜不适合的性能引起的。如果改用平场消色差物镜就可得到全视场清晰而平坦的图象。所以在结构和层次的优劣，也取决于物镜的分辨率。在进行高倍（40X）干燥系物镜的显微摄聚焦到被检物体上，更重要的是产生与物镜相适应的光束使图象的反差和焦深处在最C反差滤色镜（绿和橙黄色）这是拍摄黑白照片专用的。它是为了使标与照片上的色调相一致，起着有时加强反差，有时减弱反差的作用。通常用绿滤色镜F吸热滤色镜这是在拍摄生物标本时，吸收来自光源的红外线，为避免因热辐射而使生物标本（如活细胞等）死亡而使用的一种滤色镜。滤色镜本身带有一种很浅的颜色，所以在拍摄彩色照片时颜色会发生变化，需要加彩色补偿滤色镜（CC10Y或(2)光源的色温及色温平衡滤色镜光源的色温，即光源的放射能，它是由波长来表现的，也就是由光的颜色来表现的。色温以“°K”作单位，是以标准黑体的绝含颜色的成分，而不是指光线中冷热的温度。日光的色温为5彩色摄影，则就不能得到正确的颜色还原。显微镜的照明光源多为低压钨丝灯和卤素随之升高。由于钨丝灯与卤素灯的色温与日光相差很多，因此，显微摄影时必须设法（二）适合显微摄影的显微摄影装置测光表，测出光值后，先推出正确的曝光时间，再进过镜头照射在一面呈45度角的反光镜上，然后光线向上反射透过聚焦屏进入五棱镜，光②光圈：控制进光量。向上转动光圈环至下一个f/光圈数（例如从f/4到用标准镜头拍摄的影象与我们用裸眼看的景物大致相仿。大部分35毫米单反机都（3）照相机的其他部件:机身、快门和快门调节装置、取景器、测距器、闪光1．显微摄影装置的放大倍率照片的放大倍率，决定于照相目镜的型号和显微摄影（1）有限远光学校正系统：照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率2．物镜与目镜的不同组合，得到的分辨率不同即使照片的总放大倍率相同，它的3．标本画面的构图显微摄影时，视场中的标本往往不适合摄影构图，克服这个问（一）工作前的准备及灰尘，均会影响照片的质量。物镜、目镜及聚光镜等部件，如污垢长期的图像时存在着一定差异，即某人能看清视野中的图像，但并不意味着别人能看清楚60-80%，一般物镜镜头上，除标有放大倍率外，同时还标有NA值，如10×:0.25；20值代表NA值，其中NA值越大者空间分辨率相对越高。如物镜孔径为0.25，乘以80%圈缩小一档，即缩小为5/11，则曝光时间相应地增加一档，即为1/60s，这样两者的在显微摄影中绿色、蓝色和黄绿色滤光片的使用比较广泛，而红色滤光片感光度指胶片感受光的灵敏度，我国的GB制和德国的DIN制相②中速胶卷：GB21°,颗粒较细、速度适中、适合于自然光下拍摄。③高速胶卷：GB24°,颗粒细、感光速度快、适合于弱光下拍摄。指感光材料曝光显影之后，单位面积上银粒的沉积量。胶片曝3号为偏硬，4号为硬性。一般1、2号相纸用于人像及自然风光，3、4号相纸用从表面起，依次为保护层、乳剂层、白粉层和纸基层。保护层为明胶，防止擦伤；要用上光机烤干，有的相纸使用聚乙烯涂层加二氧化钛构成，称为涂塑纸或免上光纸，值不同，中午的太阳光的色温值约为5400K，早晚的太阳光的色温约为1900K-2800彩色负片种类繁多，但都含有3种基本乳剂层：感蓝层、感绿是经冲洗后，形成三原色的补色，经彩色相纸印放后，成为原色的图片；彩色反转片经冲洗后，直接形成三原色，成为和物体颜色相同的透明正片；彩色正片不能直接翻印成彩色透明正片。根据拍照时所应用的光源不同，彩色负片与彩色反转片还分为日光型、灯光A要求感光片有高解像力，因为显微照片需B要求对组织中的同一种颜色能显示标本C要求在背景不变的情况下，能真实地显示标本的原来颜色鉴于以上要求，适合摄影用的彩色间的彩色片，就能保证得到比较满意的质量。当拍摄暗场（彩色感光片用于生物显微摄影,即可以记录被检显微标本的结构,还可以表现其颜色和质感。制版或制作幻灯片时选择彩色反转片,摄影操作时应准确测色温并正确曝光,否则易造成颜色失真。选生物显微摄影的曝光受底片的性能、照明光源的强度与色温、滤色片的性质、物镜与目镜的放大倍数、物镜与聚光镜的孔径大小、被摄标本着色颜色及亮度等多种因素影响。低档的生物显微摄影装置一般无测光附件,正式拍摄之前必须进行试摄,记录数据求得上述综合因素对曝光影响的规律,255易率失效补偿值(胶卷生产厂家提供),依显微结构在视场中的分布情况及视场的明暗程度选择适当124时，可参考下表选用补偿滤色镜校正照片所偏的颜色需要加用的彩色补偿滤色镜Red红青CCC黑白感光片由于显微摄影所需要的拍摄条件与一般摄影不同，因而要根据摄影条件来选择感光片。高质量的生物显微照片应该具有合适的反差、丰富的层次、高的清晰度。彩色照片，它的色彩作为黑白片拍摄，明视野适宜用的是中低速全色感光片，如感光度GB（中国标准）12°、15°、17°、18°、19°、21°胶卷，纵览感光材料市场，可以见到国外某些著名厂家生产的专供生物显微摄影所需的高反差、微利全色感光片，如柯达全色微粒片（KodakPanato士低速拷贝片（FujiMinicopy,ASA32）等等。国内市场胶片、SHD-100胶片等。此类感光胶片冲洗出照片反差较好、层次丰富、清晰度高，完全满足了科研论文的图片制版、图片展览的需要。当进行暗视野和荧光观察时，为避免曝光时间过长而带来互°-21°的黑白感光片为宜。这样,既防止了用感光速度慢的底片制作出照片的结构层次较差的问题,例如，生物学的标本需要反差强、颗粒细的感光片，以得到清晰度高的摄影效果，这类感光片在市场上是能买到的，如KodakPan黑白感光片的型号很多，要使拍摄出来的照片质量优良，必须选用合适的感光片。下表供使用中参考。标本组织的条件选用的感光片ISO/ASA备注。普通病理学标本染色的部分，需要得到正常反差习惯，或者是高反差的效果KoadkPanatomic-XIlfordPanFAg按标本的颜色选用不同反差效果的滤色镜。病理学标本组织片染色的部分以及其它部分，需要得到低反差，要求标本外形的清晰度比其内部结构的层次更重要KodakTechicalPan2415Agfaortho25FujiMinicopyHR-11641002532这类感光片反差很高，而感光宽容度很窄。除非事先试拍，找出最佳曝光时间以后，再将曝光调节钮放在±1/3档上，这样才能得到既不曝光过足的正常底片。暗背景的标本组织，需要长时间的曝光，才能得到正常底片的密度KodakTri-XPanAgfapan400IlfordHP2．滤色镜在黑白摄影中的应用黑白感光片没有对色温的要求，一般表：标本的颜色滤色镜的颜色红色/黄色绿色黄色/橙色蓝色蓝色/橙色如果要减弱标本的胶片经曝光、显影后仅有25%银盐还原为银粒，组成负片上的影像，其它添（三)放大放大机有集光式、散光式和半集光式三种，在放大照片时，应根据放大时的情况进传统银盐胶片显微摄影的基本装置是感光胶片的光学照相机和显微镜,照相机是记时性。传统显微摄影只有在冲洗出照片后,才能为研究与分析提供素材和服务。它无法做到观察显微图像与研究分析的同步进行。其次,记录结果(底片和照片)容易遭受外界像精度完全一致的批次照片。更重要的是此类照片由于缺乏后期分析测量系统的支持,对图像数据的深层次分析与研究作用极为有限。因此,随着现代电子和计算机技术的成字进行描述的电子信号,最后通过计算机或其他专用设备,再把这些数字信号还原成光数码显微摄影利用显微照相装置,把显微镜下观察到的图像拍摄下来,制作成照片;或将图像信息传输、记录于其它仪器设备,以供进一步研究和分析。它不仅具有迅速而可将所观察到的现象与实验结果利用计算机显微图像分析测量系统,做更深层次的分析计算机显微图像分析测量系统(软件),则是数码显微摄影应用于实验教学的强大技计算机显微图像分析测量系统是观察分析显微镜下的微观物体,并借助计算机多媒体,对目标物体的显微图像进行统计学和形态学准确定性定量分析的程序软件。在实验借助计算机显微图像分析系统进行。目前,可用于图像处理的计算机软件非常之多,如Photoshop、Photolib、ACDSEE等,它们都具备十分强大教学中,由于各专业自身的特殊性,应该有针对地选择图像分析处理系统(软例如,用于组织细胞形态学分析或种子形态分析的计算机显微图像分析系统,除了（二）多种测量参数功能;（三）颗粒目标的标识、测量、统计分析(颗粒分布区数、面积、百分比);（四）图像组合比对功能;显微摄影后期繁琐且极易受各外在因素影响的暗房操作,因此它的影像精度远远高于传电视机实时地展现出来,以供科研和实验分析。这种实时性和精确性是传统胶片显微摄（三）数码显微摄影所生成的影像,作为数字信号可以存储于计算机、光盘或其它移动（四）由于数码显微摄影实现了与计算机的连接,所以它具备非常强大的图像编辑处理3．实验器具：解剖刀、双面刀片、毛笔、培养民、染色板导致整个片子不干净，不宜太少，不能充盈整个盖玻片的范围，还留有空气。若树胶2．固定：撕表皮：可采用镊子夹取的方法，或用挫折4．染色（整染）：爱氏苏木精染液染色，染色时间视材料不同而有所不同，总之鲜红色，纤维素的细胞璧，被固绿成绿色。就维管束来牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料2．实验器具：切片机、烤片机、解剖器、载玻片、盖玻片、酒精灯、木筷、染色⑧切成的蜡带到20-30厘米时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在黑用蛋白与甘油搅拌，同时加入水杨酸纳，调匀过滤，应用时以滤液15滴，放入纯①将展片机温度调整到35℃,保持恒定。：（F将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载2、刀钝+组织内结缔纤维较多，其中还有钙化灶，异看到的切片；或者使用专门的照相显微镜，有自己的专用片盒，可以拍35mm胶片，也数码显微摄影拍摄的图片为数字化的文档，可即刻用先将光阑缩小，用4×物镜观察，在视场内可见到视场光（1）聚光镜孔径光阑的调节：调节聚光器的孔径光阑，使聚光其得数值孔径和物光阑的边缘与物镜的边缘完全闭合或略小于物镜的边缘（1．为了增大反差，往往采用较强的照明，照完相后应及时将照明强度减弱，以免2．初学摄影者在使用手动相机拍摄时，一次可按不同的曝光度多拍摄几张，从中2．实验器具：仪器：印相机、放大机、上光机、黑白胶卷、显影罐、卷片盘、剪银为显影中心，将附近卤化银微粒的银还原出来。感光强的部分具有较多的显影中心，就没有银析出。显影进行了一段时间后，发黑程度不同的一幅黑白图像就会呈现出来，1．从照相机中取出胶卷，在暗室或暗袋重打开胶卷盒，取出胶卷。把胶片缠绕在把35毫米的胶片暗盒打开，把胶片从暗盒里头拿出来，切莫把你的手指摸到胶片倒的快而且不要停顿要连续地倒，应该是少于20秒钟以内倒完，这是说你的显影罐如在显影罐底部的胶片就会比在显影罐上部的显影的时间长一些。)倒入显影液时，最好的显影时间完毕。也可如下方法搅动：最初30秒好，注意定影的时间，定影开始的时间，把定影液注入显影罐搅动30秒钟，然后每分定影液中时间太长了，海波会使得底片漂白，就是使得底片变薄，如果定影时间不够，已经显影的胶片现在可以拿出来在水中清洗45分钟，按照显如果防渍剂太浓了对胶片是有害的，搅动约30秒钟，防渍剂能够减少水的表面张力使a：胶片在把多余的水抹掉之后，就干得更快一些，能够减少在上面落灰或其它损c：轻轻地把防渍剂撩除，可以避免在底片的表面上留下由于防渍剂太浓或水中杂含基本的捕捉和测量功能外，还包括准确的自动计数及统计导出功能，独有的SFC文件格式，方便快捷的DIS，省力的区域处理能力与强大的打印报告功能等。Motic通过选择一个区域或图像，即时简便地进行测量缩放功能使测量的起点和终点更加精确；数据将不同景深下捕捉的图像合并为一幅清晰的图像；对于景深较深、在显微镜下面积大且无法完拖曳功能；迅速简便地生成报告；使用捕捉或处理的图像；无需额外的软件；可利用互联网观看实时图像，实现远程图像共享；与同事共享信息资源，或者远程检查实验；远即使图像保存后，仍可增加或修改测量和声音；最适合集体操作项目，可供多个使用者同时操DN-3A图像分析系统是在多年科研实践基础上开发出来的24位真彩色通用图像检测与分析软件。该软件以数学形态学为基础，采用了大量先进的图像处理与分析算法，可以完成各种显微图像的处理、分析和检测。DN-3A图像分析软件的每一条代码都经过反复推敲和严格测试，具有很高的医药、生物、化工、摩擦学等各种需要利用图像手段进行统计学和形态学自动分析、测定的领域。凡是与图像形态学有关的各种检测与分析都可以利用DN-3A来完成。例如组织细胞形态学分析，金属显微组织及晶粒度分析，油料中污染物含量分析，农业种子形态分析，各种微小异形零件几何尺寸测量，化学工业中各种反应物粒子的形态分析等都可以利用DN-3A来完成。利用DN-3A提供的分析结果，可使企业质量控制更具科学依据，提高企业管理水平和对外形像，是企业从事科技新产品最新的程序设计手段，全汉化图文界面，可泊位图形工具条，使用简洁、直观、方便、快捷，可完成包括色度调整，图像变形，数学形态学处理，图像增强，图像匹配，纹理分析，特征识几何参数测量功能，细长体、块状体、颗粒体、线状体等各种特征体的自动定量分析功能，分彩色图文报告编辑制作功能，可完成各种形式的彩色图文报告，图像、分析数据及统计分布直图像输出功能，可以照片质量输出图像，输出图像的大小和位置可任意调整，并能按严格的标直线、曲线、圆、椭圆、矩形、任意形的长度、角度、面积、周长不点与直线位置测量、直线RGB各通道加、减、乘、除、与、或、非、与非、或非、最大、最小、距离、特征与等运分析目标扩大，分析目标缩小，边界圆滑、分析目标删除、孔洞填充、内外轮廓抽取、形态学分析结果与图像之间直接影射显示。特定目标及其长轴、质心、外接矩形、凸包，编号等抽取与计算。利用这些参数，还可以进一步完成一百多项统计分析，故系统总共可完成一万多项参数分析。在实际应用中，并不需要所有这些参数，可以通过分析参数设定功能来确定实际要输出的分析在实际应用中，经常会遇到需要多次重复的操作，这时可以用自动分析与处理步骤设定功能，实现自动处