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DB21DB21/T2537—2015蓝舌病病毒荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCR辽宁省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。GB/T6682分析实验室用水规格和试验DEPC:焦碳酸乙二酯(DiethylTaq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)RNA:核糖核酸(RibonucleicAciTranscriptionPolymeraseChainReacti采用TaqMan方法,比对蓝舌病病毒基因组S基因的核苷酸序列,设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示),3'荧光信号。PCR反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈5试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级5.1试剂5.4.20.01mol/LPBS(见5.4.4三氯甲烷。5.4.5乳糖蛋白胨缓冲肉汤(BLP,见附录5.4.7异丙醇(-20℃预冷)。(pH8.3见附录A),2.5mmol/LMgCl2(见附录A)。可采用等效商品化试剂。5.4.9dNTPMixture(各10mM)、Taq酶(5U/μL)。5.2仪器与耗材5.4.3微量移液器:0.5μL~10μL,5μL~20μL,20μL5.4.10离心管5.4.11微量带芯吸嘴(10μL6生物安全要求采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次用无菌的剪刀剪取待检样品5.0g后,再加10m链霉素2000μg/ml)加入于研钵中充分研磨,4℃浸提4h,取上清液5ml用超声取加入肝素(10IU肝素/5ml)抗凝血5ml,用磷酸盐缓冲液(PBS,配4℃10000g离心15min。将水相转移到新管中,加离心5s,冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于-7),将7.4.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序。循环参数设——第三阶段,94℃20s、45℃8结果判定8.4.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件,此实验视Ct值≤30,且出现特定的扩增曲线,表示样品中存在蓝舌A.1DEPC水去离子水按0.1%加入DEPC,37℃静置过夜,采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后称取17g氯化钠,用适量蒸馏水溶解,量取13mLA液和87mLB液,混合,用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压A.375%乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液,加入双蒸水中,充分混匀,定容至100A.450mmol/L氯化钾(50mmol/LK称取3.73g氯化钾,加入双蒸水,充分溶解,定容至1000mlA.62.5mmol/LMgCl2称取0.059gMgCl2,用双蒸水溶解,定容A.

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