真核细胞rna提取的实验报告范文

Word1/1真核细胞rna提取的实验报告范文篇二：真核细胞RNA的提取

RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要讨论对象，分别制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。

真核细胞总RNA分别提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分别的关键是尽量削减RNA酶的污染。RNA酶活性特别稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量制造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采纳RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采纳焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取的关键

真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有效破裂；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分别；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

二、组织RNA提取的基本步骤

1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。

2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧

化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3.主要步骤

（1）取组织50~100mg，加0.8mlTrizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。

氯仿，充分震荡混匀，静置

0.5ml异丙醇，颠倒混匀。－

1ml75%乙醇溶液，漂洗沉

淀，

10min。

lDEPC溶液，充分溶解RNA

RNA溶解液，按肯定比例稀释后，紫外分光光度计测

值，计算OD260/OD280

OD260＝1时，RNA浓度约为

）＝OD260×稀释倍数×40

1%甲醛变性胶电泳观看

甲醛变性凝胶板：4.5μlRNA，120xxg×℃静置2h，4℃1.7~2.0，依据下述公式计算×甲醛胶电泳缓冲液，离心。弃沉淀。×10min×5min离心。：1之间，说明RNA浓度：3%过氧化3.5μl37%甲（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，120xxg离心。（4）弃上清，取沉淀，加入，7500g（5）弃上清，沉淀真空干燥（6）加40μ。4.结果鉴定（1）紫外分光光度计检测：取定260nm、280nmOD比值，假如比值在RNA纯度可。标准样品当40μg/mlRNA浓度（μg/ml。（2）电泳检测：RNA质量，电泳槽及制胶板先用氢浸泡过夜；制1%，2ul5

醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65℃变性15min后，快速置冰浴中；再加入2μlRNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1～2h；暗室内紫外光下观看，拍照；假如观看到清楚的18S、28SRNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品－70℃保存备用。

三、留意事项

1、全部玻璃器皿160～180℃高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1%DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。

2、试验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。

3、试验操作过程中要戴一次性手套，以避开RNA酶污染。

药大0942605

篇三：真核细胞rna提取

试验原理：

依据成熟雌蟾蜍体内含大量卵细胞且可以便利猎取，细胞内含核酸丰富，没有其它组织器官等的干扰等优点以确定蟾蜍卵细胞为试验所需的真核细胞。通过TRIZOL溶液中变性剂破裂真核细胞，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再利用RNA不溶于异丙醇的性质将自身析出，达到分别提纯的目的。

TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增加抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消逝，导致细胞结构降解，核蛋白快速与核酸分别。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

甲基绿—吡罗红为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与吡罗红作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；吡罗红与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其缘由可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而吡罗红则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。09419

试验材料：

（一）试剂

1.甲基绿—吡罗红染料：①染色剂A液的两种配制方法

第一种方法：取吡罗红甲基绿粉1g，加入到100mL蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。

其次种方法：取甲基绿2g溶于98mL蒸馏水中，取吡罗红G5g溶于95mL蒸馏水中。取6mL甲基绿溶液和2mL吡罗红溶液加入到16mL蒸馏水中，即为A液，放入棕色瓶中备用。（留意：用于核酸染色的是吡罗红G，请不要错买吡罗红B。）

②染色剂B液的配制方法B液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4g，用蒸馏水溶解至1000mL备用；再取乙酸12mL，用蒸馏水稀释至1000mL备用。取配好的乙酸钠溶液30mL和稀释的乙酸20mL，加蒸馏水50mL，配成pH为4.8的B液（缓冲液）。

③染色剂的配制染色剂是由A液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是试验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应当留意的是该试剂应现配现用。

2.TRIZOL试剂（Invitrogen公司购买）

3.75%乙醇

4.氯仿

5.异丙醇

6.Nacl(0.14m/l)

（二）器材

1.离心机（3000r.p.m）

2.冰浴

3．研钵

4.烧杯

5.量筒

6.试管

7.玻棒

8.胶头滴管9

9.离心管

10.天平

试验方法：

制备匀浆：

以班级为单位，称取也许10g蟾蜍卵细胞（2~3℃保存），于研钵（可置于冰浴锅上）中，依据10~30mg组织细胞加1mltrizol试剂的量加入其中，快速研磨，制备匀浆。试验二人合作为一组，每组取也许10ml匀浆。

RNA的提取：

取回匀浆后，室温静置10min，使样品充分裂解——离心(3000r.p.s)20mins——取上清液移至新的离心管——加1/5TRIZOL溶液体积氯仿——在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。——离心20mins——取上清液——在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10min。——充分混匀，静置10minute——离心20min——沉淀用75%乙醇洗涤两次

定性试验：

取2支洁净试管，一管加入1.5MLRNA溶液（将RNA颗粒状的沉淀溶于

2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸馏水1.5ML,像两管中加入3M甲基绿-吡罗红染色剂，溶液变成红色为阳性反应。

试验结果：