非洲猪瘟病毒基因IⅡ型重组毒株、基因I型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鉴别三重荧光PCR检测方法

1株鉴别三重荧光PCR检测方法本文件规定了非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、本文件适用于猪血清、组织、口腔拭子、肛门拭子等样品中的非洲猪瘟病毒核酸检测及基因Ⅰ/Ⅱ型NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4符号和缩略语实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timefluorescencepolymerasecASFV：非洲猪瘟病毒毒（AfricanswiBHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate）FAM：羧基荧光素（CarboxyfluoresceiHEX：六氯-6-甲基荧光素（HexachPBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链式反应（polymeraseRNA：核糖核酸（RibonucleicROX：无活性荧光参考染料（Carboxy-X-rhodamin2Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNTEBuffer：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbufferso选取商品化的病毒DNA与RNA共提取试剂盒并参照说明书进选取商品化的Taq酶扩增试剂盒并参照说明书进行配液与扩增。B646L-F1B646L-Probe1X64RX64R-F15’-GGTTCCAAAACAATATTGGCC-3’X64R-R15’-TATTTCACATCCGTGGCATCT-3’X64R-Probe1MGF-R1MGF-Probe1CY5-5’-CAGAAGACGGGGTTCGGATACA-3’-BHQ23超净工作台、离心机、电脑、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、微小，淋巴结选取出血严重的整体采集，将所采集样品放入7.1.3口腔拭子样品采集：用医用将拭子浸入1ml50%甘油-PBS保存液中保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏或冷7.3.3口腔拭子样品、肛门拭子样品：充分涡旋震荡含有口腔拭子的管子30s，尽力挤压拭子后，应管中盖上PCR反应管盖，转移至样本处理区备用。A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液的制备见附录A.5，4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-内标8.2加样（样本处理区）待测样品提取反应体系设为25µl195℃：15s9.1合理调整阈值线，不同仪器可根据仪器噪音情况进行5等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表6扩增非洲猪瘟病毒HLJ/18株B646L基因全长(1941bp)，序列参见附录B.1，将非洲猪瘟病毒B646L基连接于pCAGGS载体，构建重组质粒pCAGGS-3X；扩增非洲猪瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全长及其两端序列(1321bp)，序列参见附录B.3，将非洲猪瘟病毒MGF_360-14L基因全长及其两端序列(1321bp)连接于pCAGGS载体，构建重组质粒pCAGGS-3M；用1×TE缓冲液将重组质粒pCAGGS-3P、pCAGGS-3X、pCAGGS-3M稀释至分别约104copies/µl，保存于-20℃备用。pCAGGS载体质粒图谱及序列参见附录B.4。PBS（0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4）配方见A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液配方见表A.4表A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-7MGF-F1（10µM）MGF-R1（10µM）MGF-Probe1（10µM）A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液配方见表A.5表A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-HighAffinityHotStartTaq(5U/µl)A.6A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-内标人工合成一段随机DNA片段（67bp）作为内标序列片段，序列参见约104copies/µl，保存于-20℃备用。pUC57载体质粒图谱及序列参见附录B8B.1非洲猪瘟病毒HLJ/18株B64genecomplement(103618CDScomplement(103618..105/translation="MASGGAFCLIANDGKADKIILAQDLLNSRISNIKNVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPKVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHDMVGHHILGACHSSWQDAPIQGTSQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRPIVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQPPLALWIKLRFWFNENVNLAIPSVSIPFGERFITIKLASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACSSISDISPVTYPITLPIIKNISVTAHGINLIDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYISWDTDYVGSITTADLVVSASAINFLLLQNGSAVLRYST"ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATTGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATTTTAATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATCACGGACGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCCC9CAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACAACCTGTTTGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCTAA注：划线部分为质粒pCAGGS-3P构建用引物覆盖部分，加粗部分为非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/和Ⅱ型毒株鉴别三重荧光PCR检测方法中FAM通道检测B.2非洲猪瘟病毒SD/DY-I/21株X64R基因全长及其两端序列(963bp)/translation="MLLYIVIIVAYVSYKLVPKQYWPILMFMAYMVYTHEKLDINERSGFWKYIIAKLFRCHGTGGTTTGCTGACTATTTGGAATTTATAGAAGCAAAAATAGATACTTTTACTAATAGCAGTGCATTATAAGTGATCAAAATTTAACATAAAAAAGGTACACATCAACATCATTCATTTGTTTCATGATGTTTGATTCATTACTTTCTACAATCACTGGGGGGGGGGTCTCTCATAGCTTTAGTATTGCTATGGTTTACTAATTATTATGTAGAATTTATAGGAGCAGATATATATGGTGGTAATTGTACTCTATAAGTTTATAAAAATTTCAGTATATTTTTTTTGTTAATATAACAGAAATGATTTAAATTACAAAAAAAAGAGAATCATCATGCTATTATACATTGTTATTATAGTAGCATATGTAAGTTATAAATTGGTTCAAATTAGATATAAATGAAAGATCCGGATTTTGGAAATATATTATAGCAAAACTATTCATTAAAAACATAATACGAAGTGTAATAATTGACTATTTTTTGTTGAATGGAAACTGTTTTTGAGTAATATGTTGAACATAATGGTTTTTATAGATGTTAAATCATTTGATTGTAGTAATTGTACTAAATGATGTGAGATATAAACCTAGTTCAATCAAAATTTAATTTTTTTATAAAAAGCTACAGAGTGTTTTATTAAACGTAGCTTATTTAAAAAGTTACACAATGTTAAAATCTCTACTTACTTTAATTCTTTGTGGGGTTTTAtTAACTTTATCCATATTATGGCTTATTACTTACCATGTAGAACTTATAGAAGCAATAGATGATTTCTACGACTGAAATATAGAATAGTTCATTTTCTATTTGTAAAATAATGATTTATATTCTCTCCTAAAAATACGATCGATCCTTTATATGCTTTGAAAACG注：划线部分为质粒pCAGGS-3X构建用引物覆盖部分，加粗部分为非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组B.3非洲猪瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全长及其genecomplement(275CDScomplement(27568..2/translation="MLSLQTLAKKVVACNYLSSDYDYTLQRFGLWWDLGPIHLCNNCKQVFSYKHLQCFSEDDLCLEAALVKELIRLFVDWGANPEYGLIRVPAVYLKRLCAELGGLTPVSEPRLLEILKEVARLKSCAGVLLGYDMFCHNPLLETVTRTTLDTVTYTIPLTGDTAHHLLTKFWFALALRHNFTKAIHYFYKRHKNHLYWRVACSLYFNNIFDIHELCREKEICISPNLMMKFACLREKNYAAIHRLGASLDYGMNLSIYNNNTLNMFFCIDLGGCRTAATAACGCTAGAAGGCTTGTTTATAAGACAGTCATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATGATCTATAACTATAATTTCTGGATGGGCTGTAAGATACTCTTCGGCTCGTTTCAGATTTTTTGAAGTATATGTCTTTAGCATATCATATATTTCCTGGGGTTCGGTTACATCTAATACCAAGGTCACATCACGGCTGAAAAGCTGCTTTACTAAGAAAATGTTGCTCAAGTTATACATATAAGCTTTGTGCGCAATGAGTTGTGCCCTATCAAAATCGGCAGCCCCCCAAATCAATACAGAAAAACATGTTTAAAGTATTATTGTTATAGATAGAAAGATTCATGCCATAATCGAGACTAGCCCCCAACCTATGACAGTAATAAATGGCCGCGTAATTTTTTTCCCGCAAGCAAGCAAATTTCATCATCAGATTAGGGCTGATGCAAATCTCTTTTTCACGACACAACTCGTGTATGTCAAAAATGTTATTAAAATAAAGGCTACAAGCTACCCGCCAATAGAGGTGATTTTTATGCCTTTTATAGAAATAGTGAATAGCCTTTGTAAAATTATGTCGTAATGCCAGGGCAAACCAAAACTTTGTTAATAGGTGGTGCGCCGTATCCCCCGTCAACGGAATGTTTGAACAGGTGTACGTAACTGTGTCTAAAGTGGTTCTAGTTACGGTTTCCAAGAGTGGATTATGACAAAACATGTCATAACCCAGCAGAACTCCTGCACAGTTCCAGAAGACGGGGTTCGGATACAGGCGTTAAGCCATATTCAGGATTTGCGCCCCAATCCACAAATAAACGTATAAGTTCAAGATTATCGCTCTTCACGGCCTTTACTAGCGCCGCTACAAAGATCATCCTCAGAAAAACACTGTAAATGTTTATACGAAAAAACTTGCTTACAATTGTTACATAGGTGAATAGGACCTAAATCCCACCACAAACCAAAACGCTGCAACGTATAATCATAGTCACTTGAAAGATAATTGCATGCCACAACTTTTTTGGCCAACGTTTGTAAAGACAACATACTAAGTTTAAAACATCTTAAATCTAAGCTAGCTAACTTTCAAGAAAACCCTCTATCCCTAAGAATATATCTTATAACTAGACTTATAGCAGTAAAAATCAACTTTGGTTATTCTTTTTAATATAAAACGTCTAATTACTTGCAAAGGACTATAAAGCCCA注：划线部分为质粒pCAGGS-3M构建用引物覆盖部分，加粗部分为非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组PropagationinE.coliGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGCCGCGCGCCAGCCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTGTTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGAGCTCATCGATGCATGGTACCCGGGCATGCTCGAGCTAGCAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG注：加粗部分为猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪delta冠状病毒三重荧光RT-PCR检测GAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAATCTGACAGTTACCA