化学品 啮齿类动物亚慢性经口毒性试验方法 征求意见稿

1GB/TXXXXX—XXXX化学品啮齿类动物亚慢性经口毒性试验方法本文件规定了化学品强化快速生物降解性试验的术语和定义、方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本文件适用于化学品的亚慢性经口毒性试验。2规范性引用文本文件没有规范性引用文件。3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1剂量dose系指所受受试物的量，常以质量(g、mg)或动物单位体重所给予的受试物的量(mg/kg)来表示；如将受试物掺入饲料进行喂养染毒时，也可以用受试物在饲料中的恒定质量分数(mg/kg)来表示。3.2用量dosage包括染毒剂量、染毒次数及染毒期限在内的一般性术语。3.3未观察到有害作用的剂量no-observed-adverse-effectlevel(NOAEL)系指未发现与染毒有关的有害作用的最高剂量。3.4雄激素性androgenicity指一种化学物质在哺乳动物机体中像天然雄激素（如睾丸素）一样发挥作用的能力。3.5抗雄激素性antiandrogenicity是指一种化学品在哺乳动物机体中抑制天然雄性激素（如睾酮）作用的能力。3.6抗甲状腺活性antioestrogenicity是指一种化学物质在哺乳动物机体中抑制天然甲状腺激素（如T3）作用的能力。2GB/TXXXXX—XXXX3.7显著毒性evidenttoxicity描述在施用试验化学品后出现的明显的毒性迹象。这些迹象应足以进行危险评估，随着染毒剂量的增加可望导致严重的毒性症状和死亡。3.8雌激素性oestrogenicity是指一种化学品在哺乳动物机体中像天然雌激素（如雌二醇）一样发挥作用的能力。3.9甲状腺活性thyroidactivity是指一种化学物质在哺乳动物机体中像天然甲状腺激素（如T3）一样发挥作用的能力。3.10验证validation是一个科学过程，旨在描述一个测试方法的操作要求和限制，并证明其对特定目的的可靠性和相关4试验基本原则将受试物每日以不同剂量经口给予几个试验动物组，每组一个剂量。连续染毒90d，染毒期间要密切观察动物的毒性作用。对试验期间死亡和试验结束时存活处死的动物要进行大体解剖检查。5试验方法5.1实验动物和饲养环境5.1.1动物的选择首选大鼠，也可以使用其他啮齿动物物种（如小鼠）。一般应使用常用的品系和健康初成年的动物。雌性动物应未受孕或产过仔的，鼠龄以断奶后为宜，不宜超过9周龄。在试验开始时的动物体重差异不得超过同性别平均体重的±20%。如果试验是长期试验的前期预试验，这两项试验应使用同一品系，同一来源的动物。5.1.2饲养条件试验动物房的温度应为22℃±3℃。相对湿度应为30%-70%，以50%-60%为最佳。人工光照时，应12h明，12h暗。饲以实验室的常规饲料，饮水不限，喂饲时受试物与饲料充分混合。应注意避免饮食或动物垫料中可能含有不可接受的高浓度激素活性物质，容易或可能干扰研究结果的解释（如植物雌激素）。已知实验室饮食中高水平的植物雌激素可增加啮齿动物的子宫重量。动物可单笼饲养或按性别少量动物群养，群养时每笼的动物数以不干扰对动物的观察为宜。5.2动物准备3GB/TXXXXX—XXXX健康动物应未进行过其他试验，在染毒前应在实验室至少适应5d。应注明所用动物的品系、来源、性别、体重和年龄等信息。应将动物随机分成染毒组和对照组。笼具的放置应尽可能减少因放置造成对试验的影响。对每只受试动物进行唯一的标识，方法包括环割、标签、微型芯片和生物识别。5.3受试物准备根据研究目的和受试物的理化特性，受试物可通过灌胃、或将受试物加人饲料混合或饮水进行喂养染毒。需要时将受试物溶解或悬浮于适当的赋形剂中，尽可能制备成水的溶液或混悬液，其他可选谷物油类（如玉米油）作溶剂，或其他溶剂。但是需要对非水赋形剂的毒性特点必须了解。应当测定制备物中受试物的稳定性。6试验过程6.1数量和性别每个剂量组至少选用20只动物(雌雄各10只)；假如设计要定期处死动物，尚需增加动物数。根据对受试物或同系物已有的资料，如需要可设雌雄各5只的附加组作为附加对照，以高剂量组的剂量染毒，在停止染毒后该组动物暂不处死，用以观察是否有迟发毒作用和毒性作用的可逆性，其时间的长短应根据所观察到的毒性来确定。6.2剂量设计试验至少设三个染毒组和一个同步的对照组，但限度试验例外。可根据重复染毒试验和进行的确定染毒剂量范围的预试验的结果，并结合受试物或结构相关化合物已有的毒理学和毒代动力学的研究数据进行剂量设计。依据受试物的理化性质和生物作用最高染毒剂量应使动物产生较明显的毒性，但不应引起动物死亡和承受明显的痛苦。按照递减序列设计多个中间剂量组以观察剂量反应关系，最低剂量组应为无明显有害作用剂量(NOAEL)。递减序列的组间隔一般为2倍-4倍，相比采用较大的剂量间隔（例如，6-10倍间隔），增加第4个剂量组更可取。对照组除了不用受试物染毒外，其他的处理应与染毒组动物相同。如使用了赋形剂应设赋形剂对照组，该组以各染毒组中使用赋形剂量最大组的使用量来进行试验。如果混入饲料中的受试物使动物的进食量减少，应设计饲料配对对照组，用于鉴别是毒性导致进食量降低还是受试物影响饲料的适口性导致进食量降低。应注意到所加的赋形剂或其他的添加物对受试物的吸收、分布、代谢和体内滞留时间影响，对受试物的化学性质影响而引起的毒性改变。也应考虑到对动物进食和饮水的消耗量和营养状态的影响。6.3限量试验在本试验中，如果以每天1000mg/kg或大于1000mg/kg的剂量染毒未产生可观测到的毒性效应，或根据结构相关化合物的预期受试样品毒性很低，可不必设三个剂量水平的试验。但人类接触水平的资料表明需要高剂量进行试验时，不能应用此剂量进行限量试验。6.4染毒步骤每天染毒动物，通常每周染毒7d，至少连续90d。也可采用每周染毒5d等模式，但需要说明理由。经口灌胃染毒，应通过胃管一次灌胃，灌胃量取决于实验动物的大小，一次染毒最大量不宜超过1mL/100g4GB/TXXXXX—XXXX体重，但在水溶液时可达2mL/100g体重。由于较高浓度的受试物通常可引起激惹性作用，故除了刺激性或腐蚀性的物质之外，各剂量组应通过浓度调节，尽量使每个剂量组的灌胃体积一致。如果受试物是通过饲料和饮水染毒，应保证染毒剂量不会对正常营养和水平衡产生影响。当喂饲染毒时受试物在饲料中应为恒定浓度(ppm)，或是以动物体重、受试物的浓度和动物进食量计算出实际剂量[mg/(kg·d)]来表示。若采用灌胃方式染毒，则每日应在相同的时间染毒，并应定期（每周）按体重调整灌胃量，维持染毒剂量不变。其他的染毒方式要加以特殊说明。如果90d喂饲染毒试验是长期慢性毒性试验的预试验，则两项试验的饲料应当相同。6.5临床观察6.5.1观察期限至少为90d，对设有观察恢复期的附加组的动物应在停止染毒后继续察一个时期，以观察毒效应的持续性和可逆性。在试验期间至少每天对动物进行一次临床观察，建议在每天相同的时间进行观察，最好是在染毒后预期中毒症状出现的高峰期。应当记录动物的临床状态。每天至少二次（通常定为早晚各一次检查动物有无发病或死亡。在首次染毒前应对所有动物作临床观察至少一次（可以作内对照比较），以后每周一次，对所有动物都进行详尽的临床观察。每次应在相同的时间，将动物取出笼外，以相同环境条件下检查，要按照统一规定的观察标准进行检查和评分，并记录。应尽量减小观察操作的误差。观察内容包括但不限于皮肤、被毛、眼、黏膜、分泌物和排泄物和自主神经活动（例如流泪、竖毛反应、瞳孔大小及异常呼吸）。还应记录步态、体位和对声音、触摸的反应，和其他如阵挛、强直性运动、刻板的重复动作（如过度梳理、反复转圈)或反常行为(如自残、后退步态)等。在试验前对所有动物和试验结束时至少对高剂量组和对照组应用适当的眼科器械进行眼科检查。如果观察到异常应对其他染毒组也进行检查。在染毒期结束前(约在11周前)，应对动物感官刺激反应性（例如：听觉，视觉及本体感觉刺激）、握力和运动能力进行评估。其详细操作可参照有关文献，也可使用文献以外的其他方法进行检查。6.5.2如果可以从其他研究得到功能观察的资料，或者本试验的每天临床观察未见功能缺损时、或动物毒性症状影响功能测试项目完成时，则功能观测可省略。6.6体重和食物/水消耗应每周称量所有动物体重一次。至少每周测量一次饲料消耗量。如果是通过饮水染毒，每周也应测定饮水消耗量一次，即便是经饲料和灌胃染毒，因其可能改变饮水量也应测定水的消耗量。6.7血液学和临床生化检查6.7.1在实验接近结束时进行血液学检查，或是在处死之前或是在处死动物的同时从动物指定部位采集血样并储存在适当的条件下。包括红细胞比积、血红蛋白浓度、红细胞计数、网织红细胞计数、白细胞计数及其分类、血小板计数和凝血时间、凝血能力的测定。6.7.25GB/TXXXXX—XXXX血液临床生化测定，研究对组织的主要毒性作用，特别是对肾脏和肝脏等组织的毒性效应。在处死之前或是在处死动物的同时从每只动物采集血液样品进行临床生化测定（垂死和/或试验期间处死的动物除外）。与血液学检查相同，试验期间采集的血液样品也应进行临床生化测定。建议采血前让动物禁食过夜。血清或血浆中的测定应包括钠、钾、葡萄糖、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、血尿素氮、肌酐、总蛋白和白蛋白以及两种以上反应肝细胞功能的酶，例如丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰胺转肽酶和山梨醇脱氢酶。测定其他酶（肝脏或其他来源）、胆汁酸以及胆红素在某些情况下也是有用的。6.7.3此外，应考虑检测一般组织损伤的血清标志物。对已知或怀疑受试物的性质具有可能影响有关的代谢过程，则应测定钙、磷、空腹三酸甘油脂、特异的激素、高铁血红蛋白和胆碱酯酶。根据受试物的化学特性和预期的毒性效应等具体情况，确定所需的检测项目。6.7.4血清总T4、T3和TSH应在研究结束时从实验组和附加组和/或恢复组的每只动物身上取得的样本进行测量。其他激素，如睾酮、雌二醇、促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH），应视具体情况而定。血清可以冷冻保存，以便根据其他终点（如器官重量和组织学）观察到的结果来确定信息量最大的激素进行分析。如果有历史资料支持，可以在血浆中测量激素。以下因素可能影响激素测定的变异性和绝对浓度：a)不同的处死时间可能由于激素浓度的昼夜变化产生影响；b)实验动物处于发情周期；c)动物处死的方式，有可能对动物造成不必要的压力，从而影响荷尔蒙的浓度；用于激素测定的检测试剂盒，可能因其标准曲线而不同。专门用于激素测定的血样应在相同时间获得。分析激素浓度时获得的数值与各种商业检测试剂盒不同。因此，可能无法提供基于统一历史数据的性能标准。应考虑到对照组激素水平（在同一实验室、同一啮齿动物品系和使用同一方法测量），以区分偶然和与染毒有关的变化。在可能的情况下，应采用最适方法进行血样采集、处理和分析工作。实验室应尽可能使T3和T4的控制变异系数保持在25以下，TSH的控制变异系数保持在35以下。所有的浓度都应以ng/ml为单位进行记录。T3、T4和TSH在选定的储存条件下的稳定性应作为激素检测验证的一部分进行测试。6.7.5根据需要，在试验的最后一周可以采用分段收集尿量的方式收集尿液，检查以下指标：外观、体积、渗透压或相对密度、pH值、蛋白质、葡萄糖和血液/血细胞。6.7.6如果指标的历史数据不足，在染毒开始之前，应考虑是否需要测定血液学和临床生物化学参数的正常值变异范围。一般不推荐在染毒前获取这些数据。6.8病理学检查6.8.1性器官解剖检查6GB/TXXXXX—XXXX实验结束后记录所有雄性动物的睾丸和附睾的重量。每只雄性动物至少应保留一个附睾用于组织病理学检查。剩余的附睾可用于附睾尾部精子储备、精子形态或精子活力的计数。对于精子形态的评估，附睾（或输精管）的精子样本应以固定或湿法制备的方式进行检查，每个样本应至少有200个正常精子（包括头部和中段/尾部）。精子形态异常的情况包括融合、孤立的头部、错位的头部和/或尾部。畸形或体积过大的精子头可能表明精子运动的缺陷。精子活力可以在动物处死后立即进行评估或记录下来供以后分析。渐进式运动的精子的百分比可以通过视觉或计算机辅助运动分析来确定。对精子参数的分析可限于对照组和高剂量的雄性动物。然而，如果观察到异常应对其他染毒组也进行评估。在尸检时，应通过采集阴道涂片确定所有雌性动物的发情周期。这些观察将提供有关动物处死时发情周期阶段的信息，并有助于对雌激素敏感组织进行组织学评估。6.8.2大体解剖检查对所有的动物都应进行全面详细的大体解剖，包括体表、体腔的各开口处，颅腔、胸腔和腹腔及其内容物的检查。所有动物的（不包括濒死动物和期间处死的动物）肝脏、肾脏、肾上腺、睾丸、附睾、前列腺与精囊/凝固腺（或者先将整个前列腺与精囊/凝固腺一起称重，然后单独解剖并称重前列腺）、子宫、卵巢、胸腺、脾脏、脑和心脏，在剥离干净后为避免脱水干燥，应尽快称其湿重。垂体可在新鲜解剖或固定后立即称重。剥离前列腺复合体时应小心以避免刺破精囊。另外，精囊、前列腺以及甲状腺可在固定后在进行修整和称重，以避免组织损伤影响组织病理学分析。下述的器官和组织应保存于适宜的固定液中，以保证组织的形状和随后进行的病理组织学检查；包括所有肉眼可见损害的脏器、脑（包括延髓／脑桥、小脑皮质和大脑皮质）、脊髓（颈髓、中间胸髓、腰髓三个部位）、垂体、甲状腺／甲状旁腺、胸腺、食道、唾液腺、胃、大小肠（包括集合淋巴结）、肝、胰腺、肾、肾上腺、脾、心脏、气管、肺（充分防漏后浸泡保存）、主动脉、卵巢、子宫、宫颈、阴道、睾丸、附睾、前列腺、精囊、凝固腺、乳腺（雄性和雌性）、膀胱、胆囊（小鼠）、具有代表的淋巴结（一个接近染毒途径，一个远离染毒途径的）、周围神经（坐骨神经和胫神经的远端接近肌肉的部分）、骨骼肌和骨、骨髓切片（或骨髓新鲜涂片）、皮肤、眼睛（眼科检查出现异常时），以及临床和其他观察提示需要检查的其他组织。根据已知的受试物特性，可能是毒作用靶器官的，也应一并固定保存。建议将睾丸浸泡在Bouin's或改良的Davidson固定液中保存，组织病理学评估应考虑对精索小管横截面进行分期。对睾丸进行组织病理学评估时，应注意所述的阶段性特定变化。应进行详细的组织病理学检查，例如保留精子、生精细胞层或类型缺失、多核巨细胞或生精细胞脱落到管腔内以确定与染毒有关的影响。6.9组织病理学6.9.1对照组和高剂量组所有动物的已经固定保存的器官和组织都应进行详尽的组织病理学检查。如果高剂量组出现异常，对其他中低剂量组也应进行检查。6.9.2所有肉眼见到损害的部位。7GB/TXXXXX—XXXX6.9.3如设置了高剂量附加组，染毒组中显示有影响组织和器官都应进行组织病理学检查。7试验数据和报告7.1结果处理必须提供每只动物的数据。所有数据应当用表格形式表示，列出试验开始时每个染毒组的动物数、在试验过程中死亡的动物数和死亡时间、人道处死的动物数、处死的原因及处死的时间。出现临床异常和对这些症状的详细描述，包括发生的时间、持续时间、严重程度。出现损伤的动物数，以及损伤的类型和每种损伤的对应的百分率。7.2结果评价所得到的计数数据和结果选择适当的统计学方法对所有数据进行评价。这些统计处理方法在设计试验时就应确定。在质量控制方面，建议将质控数据与来自同一实验室、同一物种、同一品系以及在类似条件下收集的历史数据进行比较。此外，对附件B中有关内分泌的连续参数计算变异系数。在评估历史控制数据时，应考虑到大鼠品系之间的差异。7.3试验报告试验报告包括下列资料：7.3.1受试物a)化学标识，如IUPAC或CAS名称、CAS注册号、SMILES或InChI代码、结构式和/或其他标识符；b)来源、批号、使用限制日期（如果有的话）；c)化学品的稳定性（若为已知信息）；d)物理性状，纯度和理化性质；e)名称和识别码，包括已知/已确定的CAS号码。7.3.2单一成分的物质物理外观、水溶性，以及其他相关的物理化学特性。7.3.3多成分物质，UVBC和混合物尽可能通过化学特性（见上文）、成分的定量和相关的物理化学特性来描述。7.3.4赋形剂(如果使用了)赋形剂不选用水的理由。7.3.5试验动物a)动物品系；b)动物的年龄、数量和性别；8GB/TXXXXX—XXXXc)动物来源、饲养条件及饲料；d)染毒开始时每只动物的体重；e)如果不是大鼠，阐述所选物种的理由。7.3.6试验条件a)叙述剂量水平设定的理由；b)受试物的剂型饲料配制及受试物在饲料中浓度、稳定性和均匀性详细资料；c)染毒操作的详细描述；d)详细描述如何将饲料和饮水中的受试物浓度换算成实际剂量[mg/(kg.d)];e)饲料和饮