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备案号：51404-2016DB32PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ江苏省质量技术监督局发布I本标准主要起草人：陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、1鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试SC/T7014-2008水生动物产地3.5MgCl2（25mmol/L生化试剂，-20℃保存。2GoldviewTM核酸染料或其他宜使用的核酸4仪器和设备有临床症状的鱼，如体长不超过4cm，取鳃；体长为4cm~636.1.2加入600μL酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）至样品离心管中，持续上下颠倒用力混合至少1min，12000r/min4℃离心10min，小心取上层水相（约700μL）置于新的1.5mL离心管中。），6.1.4加入-20℃预冷的1.5倍体积无水乙醇（约900μL倒转数次混匀后，置-20℃沉淀1h以上。6.1.512000r/min4℃离心30min，小心去上清，倒置于吸DNA抽提也可选用商品化病毒DNA抽提试剂盒，按相应说明书提供的方法予以抽提。50μL体系10×PCR缓冲液（无Mg2+）51×MgCl2（25mmol/L）5dNTP(10mmol/L)12100pmol/μL引物F111pmol/μL100pmol/μL引物R111pmol/μL灭菌双蒸水TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.025U/μL待检DNA模板或对照546.3.2将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液刚好淹6.3.3加样：10μL样品加入2μL样品缓冲液，混匀后加入样品孔。6.3.5紫外灯下观察核酸带，并7.2当PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检5试剂及其配制A.1CTAB溶液A.2酚—三氯甲烷—异戊醇A.3三氯甲烷—异戊醇A.4TBE电泳缓冲液（5×浓缩液）A.56×DNA上样缓冲液61CCCAGCAACATGTGCGACGGAGGCATCAG61TTCTGTCTCGAGTATGTCAGAAACTGCGTGCTGCTCGATTGGAAAAAGA121AGTAACATGGAAGAGATCAAGGAATACCCGCACA181TACAAGAACCGAGAGGTCGGTTGGACTCGGTTTG241CACTACCTCTCTATGAGATCTCAGTACAAGAAACGCATCAAGACCGA301CTCAAGGCGTACTATGATCAGATGCAGGGTGAGATGAAAGTATGCGC361GGCGTGAGCCAGAGTCTCTGTCAGCATCTGACTACTTGGT421CTGGTCGAGAACGCTGTAAAACACACTCCGGGTATGACC7

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