九、核糖体提取

第九章核糖体(ribosome)

概述

核糖体的类型与结构

多聚核糖体与蛋白质的合成

第一节核糖体的类型与结构核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒，其惟一功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链,所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器。按核糖体存在的部位可分为三种类型:细胞质核糖体、线粒体核糖体、叶绿体核糖体。按存在的生物类型可分为两种类型:真核生物核糖体和原核生物核糖体。原核细胞的核糖体较小,沉降系数为70S，相对分子质量为2.5x103kDa,由50S和30S两个亚基组成;而真核细胞的核糖体体积较大,沉降系数是80S，相对分子质量为3.9～4.5x103kDa,由60S和40S两个亚基组成。在真核细胞中,核糖体进行蛋白质合成时,既可以游离在细胞质中,称为游离核糖体,也可以附着在内质网的表面,称为膜旁核糖体或附着核糖体。真核细胞含有较多的核糖体,每个细胞平均有106～107个,而原核细胞中核糖体较少每个细胞平均只有15×102～18×103个。典型的原核生物大肠杆菌核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。在完整的核糖体中，rRNA约占2/3,蛋白质约为1/3。50S大亚基含有34种不同的蛋白质和两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S，相对分子质量小的rRNA为5S。30S小亚基含有21种蛋白质和一个16S的rRNA分子。真核细胞核糖体的沉降系数为80S，大亚基为60S，小亚基为40S。在大亚基中，有大约49种蛋白质，另外有三种rRNA∶28SrRNA.5SrRNA和5.8SrRNA。小亚基含有大约33种蛋白质，一种18S的rRNA。核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒,其惟一功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链,是细胞内蛋白质合成的分子机器。随着分子生物学的发展,核糖体概念的涵意有了进一步的发展。细胞内除了从事蛋白质合成的核糖体外,还有许多其它功能的核糖核蛋白体颗粒,通常是一些小分子的RNA同蛋白质组成的颗粒,它们参与RNA的加工、RNA的编辑、基因表达的调控等。一、核糖体的基本类型与成分■核糖体的类型按存在的部位:有三种类型核糖体,细胞质核糖体、线粒体核糖体、叶绿体核糖体。按存在的生物类型:分为两种类型,即真核生物核糖体和原核生物核糖体。原核细胞的核糖体较小,沉降系数为70S,相对分子质量为2.5x103kDa,由50S和30S两个亚基组成；而真核细胞的核糖体体积较大,沉降系数是80S,相对分子质量为3.9-4.5x103kDa,由60S和40S两个亚基组成。主要成分 r蛋白质:40%，核糖体表面 rRNA:60%，核糖体内部核糖体的分布常分布于蛋白质合成旺盛的区域，其数量与蛋白质合成程度有关。核糖体的大小亚单位在细胞内常常游离于细胞质基质中，只有当小亚单位与mRNA结合后，大亚单位才与小亚单位结合形成完整的核糖体。肽链合称终止后，小亚单位解离，又游离存在于细胞质基质中。非共价键

各种来源的核糖体亚基组成来源完整核糖体核糖体亚基核糖体RNAs 细胞质80S60S(大亚基)28S(真核生物)40S(小亚基)18S,5.8S,5S细胞质70S50S(大亚基)23S(原核生物)30S(小亚基)16S,5S线粒体55-60S45S(大亚基)16S(哺乳动物)35S(小亚基)12S线粒体75S53S(大亚基)21S (酵母)35S(小亚基)14S线粒体78S60S(大亚基)26S(高等植物)45S(小亚基)18S,5S叶绿体70S50S(大亚基)23S30S(小亚基)16S,5S 核糖体的生物发生(biogenesis)核糖体的合成和装配过程相当复杂。真核细胞和原核细胞的核糖体合成和装配过程各不相同。核糖体的生物发生包括蛋白质和rRNA的合成、核糖体亚基的组装等。

核糖体rRNA基因的转录与加工核糖体的组成成分是蛋白质和rRNA,所以编码核糖体的基因分为两类,一类是蛋白质基因,另一类是rRNA基因。在生活细胞中,特别是在活跃进行蛋白质合成的细胞中,需要大量的核糖体,这就意味着需要合成大量的rRNA和核糖体蛋白质。

■编码rRNA基因的过量扩增细胞为了满足大量需求的rRNA，通过两种方式扩大rRNA基因的拷贝数:●在染色体上增加rRNA基因的拷贝数，如在细菌E.coli的基因组中有七套rRNA基因，而典型的真核生物细胞含有几百到几千个28S、18S和5.8SrRNA基因的拷贝，5SrRNA基因的拷贝数多达50000个。●通过基因扩增(geneamplification)。科学家用两栖类的卵细胞(卵母细胞)研究在发育过程中rRNA基因的扩增。发现两栖类卵母细胞在发育的早期，rRNA基因的数量扩增到1000多倍。■真核生物18S、5.8S、28SrRNA和5SrRNA基因编码rRNA基因的DNA称为rDNA。真核生物有四种rRNA基因,其中18S、5.8S和28SrRNA基因是串联在一起的,每个基因被间隔区隔开,5SrRNA基因则位于不同染色体上。■18S、5.8S、28SrRNA基因转录与加工18SrRNA.5.8SrRNA和28SrRNA基因首先转录成一个45S的前体rRNA(pre-rRNA)，大约是这3个rRNA总长的2倍。能够转录这3个rRNA前体的DNA区域称为一个转录单位，意指它们有一个共同的转录起点和转录终点。●转录酶:真核生物中参与rRNA基因转录的酶是RNA聚合酶Ⅰ。●前体加工前体rRNA在核仁中被酶剪切成3个rRNA产物,转录间隔区则被降解掉。根据3H标记的尿嘧啶和放线菌素D研究人的培养细胞前体rRNA的合成的结果推测了前体rRNA的加工过程。核输入与核输出■5SrRNA基因的转录与加工5SrRNA是核糖体大亚基的一个组份,原核生物和真核生物都有5SrRNA,而且结构相似。●5SrRNA基因:真核生物的5SrRNA基因与其他三种rRNA基因不在同一条染色体上,它是由核仁以外的染色体基因转录的,然后运输到核仁内参与核糖体的装配。二、核糖体蛋白质与rRNA的功能分析核糖体上具有一系列与蛋白质合成有关的结合位点与催化位点在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究核糖体的功能位点原核生物核糖体中有四种与RNA分子结合的位点,其中一个是与mRNA结合的位点,另三个是与tRNA结合的位点。A位点(Asite)P位点(Psite)E位点(exitsite,Esite)mRNA结合位点与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点——氨酰基位点,又称A位点。与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点——肽酰基位点,又称P位点。肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点——E位点(exitsite)。与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G)的结合位点--GTP酶的结合位点。肽酰转移酶的催化位点。与蛋白质合成有关的其它起始因子、延伸因子和终止因子的结合位点。核糖体的功能位点在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究

核糖体蛋白

在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分

r蛋白质的主要功能

核糖体蛋白很难确定哪一种蛋白具有催化功能:在E.coli中核糖体蛋白突变甚至缺失对蛋白质合并没有表现出“全”或“无”的影响。多数抗蛋白质合成抑制剂的突变株，并非由于r蛋白的基因突变而往往是rRNA基因突变。在整个进化过程中rRNA的结构比核糖体蛋白的结构具有更高的保守性。在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分

具有肽酰转移酶的活性；

为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)；

为多种蛋白质合成因子提供结合位点；

在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结合以及在肽链的延伸中与mRNA结合；

核糖体大小亚单位的结合、校正阅读(proofreading)、无意义链或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等都与rRNA有关。r蛋白质的主要功能

对rRNA折叠成有功能的三维结构是十分重要的；

在蛋白质合成中,某些r蛋白可能对核糖体的构象起“微调”作用；

在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中,核糖体蛋白与rRNA共同行使功能。第二节多聚核糖体与蛋白质的合成

多聚核糖体(polyribosome或polysome)

蛋白质的合成

RNA在生命起源中的地位及其演化过程

多聚核糖体(polyribosome或polysome)概念:核糖体在细胞内并不是单个独立地执行功能，而是由多个甚至几十个核糖体串连在一条mRNA分子上高效地进行肽链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与mRNA的聚合体称为多聚核糖体。

多聚核糖体的生物学意义: 细胞内各种多肽的合成,不论其分子量的大小或是mRNA的长短如何,单位时间内所合成的多肽分子数目都大体相等。 以多聚核糖体的形式进行多肽合成，对mRNA的利用及对其浓度的调控更为经济和有效。多聚核糖体蛋白质合成的基本过程蛋白质合成，或称mRNA翻译是细胞中最复杂的合成活动。蛋白质的合成需要携带氨基酸的各种tRNA.核糖体、mRNA.不同功能的蛋白质、阳离子、GTP等的参与。蛋白质的合成，是三种不同类型的RNA通力合作的结果。在核糖体上合成多肽链，分为三个完全不同的过程:链的起始、链的延伸、链的终止。1、蛋白质合成的起始(initiation)蛋白质合成的起始涉及到mRNA.起始tRNA和核糖体小亚基之间的相互作用，最后装配成完整的核糖体。2、多肽链的延伸(elongation)一旦起始复合物形成，蛋白质的合成随即开始，此过程称为蛋白质合成的延伸。延伸涉及四个重复的步骤∶①氨酰tRNA进入核糖体的A位点；②肽键形成；③转位;④脱氨酰tRNA释放。上述四步的循环，使肽链不断延长。在整个过程中，需要GTP和一些延长因子的参与。3.终止(termination)蛋白质合成的终止是指核糖体沿着mRNA移动，如果进入A位的是终止密码子，由于没有与之匹配的反密码子，而终止蛋白质的合成。一共有三种终止密码子:UAA.UAG、UGA，其中任何一种进入A位都会终止蛋白质的合成，并导致多肽链从核糖体释放出来。

RNA在生命起源中的地位

及其演化过程

生命是自我复制的体系

DNA代替了RNA的遗传信息功能

蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能

生命是自我复制的体系三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribosome):具有催化作用的RNA。由RNA催化产生了蛋白质DNA代替了RNA的遗传信息功能DNA双链比RNA单链稳定；DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶,使之易于修复。蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；与RNA相比,蛋白质能更为有效地催化多种生化反应,并提供更为复杂的细胞结构成分,逐渐演化成今天的细胞。原核生物与真核生物核糖体成分的比较

E.coli核糖体小亚单位中rRNA与r蛋白的相互关系示意图线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线）（引自Albertsetal,1989）E.coli（a）核糖体小亚