可见-紫外分光光度法

紫外—可见分光光度法第一节物质的吸收光谱第二节分光光度法基本原理第三节可见分光光度法第四节提高测量灵敏度和准确度的方法第五节紫外分光光度法简介目的要求掌握分光光度法的基本原理——Lambert-Beer定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸光系等概念、相互关系及计算。熟悉标准曲线法及标准对照法。了解吸收光谱的意义及绘制方法。了解分光光度计的基本构造,提高测量灵敏度和准确度的方法。了解可见分光光度法和紫外分光光度法的异同点。

分光光度法

根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、λυ定量分析的一种方法。波谱名称波长范围分

析

方

法

射

线0.005~0.17nm中子活化分析,莫斯鲍尔谱法X射

线0.1~10nmX射线光谱法远

紫

外10~200nm真空紫外光谱法近

紫

外200~400nm紫外光谱法可

见

光400~750nm比色法,可见吸光光度法近

红

外0.75~2.5

m红外光谱法中

红

外2.5~50

m红外光谱法远

红

外50~1000

m红外光谱法微

波1~1000mm微波光谱法射

频1~1000m核磁共振光谱法第一节物质的吸收光谱

一、物质对光的选择性吸收一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地吸收某些波长(wavelength)的光而让未被吸收的光透射过，即溶液呈现透射光的颜色，亦即呈现的是它吸收光的互补光的颜色。例如：KMnO4溶液能选择吸收了白光中的绿光，与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液，所以KMnO4溶液呈现紫色。

/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿第一节物质的吸收光谱二．物质的吸收光谱（A-λ图）用不同波长(400-720nm)的光，照射某一吸光物质的溶液；测吸光度(A)，以波长

为横坐标，吸光度A为纵坐标得到的一条曲线，直观地表示出物质对光的吸收特征。第一节物质的吸收光谱特点:①具有最大吸收波长。②不同物质吸收光谱的形状及λmax不同，——定性分析的依据。③同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax

不同——定量分析的基础。第一节物质的吸收光谱④它反映某溶液对不同波长单色光的吸收程度。在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。⑤远离λmax的光,物质几乎不吸收光（A→0）,这些光的A与物质的c无直接关系----不作定量分析依据。注意：物质对光的吸收越多，呈颜色越深，溶液浓度越浓。第二节

分光光度法

基本原理

一、透光率和吸光度入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It透光率T=It/I0第二节

分光光度法

基本原理I0

溶剂

I0,

I0

溶液

It∴T=It/I0

透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。

A愈大，溶液对光的吸收愈多。即：溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收愈小；相反，透光率愈小；表示它对光的吸收愈大。吸光度A=-lgT=lg

I0/It第二节

分光光度法

基本原理二

Lambert―Beer

定律当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。

A=kbcA-吸光度k-比例常数

b-液层厚度c-溶液的浓度注意：

Beer定律仅适用于单色光。第一节

物质的吸收光谱吸光度A与溶液的透光率的关系为

A=lg(1/T)=-lgT=lg(I0/I)=kbc实验发现：溶液的浓度c愈大，液层厚度b愈厚，入射光愈强，则光吸收得愈多。式中：A为吸光度；T为透光度，T=I/I0；I0为入射光强度，I为透射光强度；k为比例系数，k与吸光物质的性质、入射光波长及温度等有关；c为吸光物质浓度；b为吸收层厚度。朗伯—比尔定律物理意义:当一束平行的单色光垂直通过某一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，其吸光度(A)与溶液液层厚度(b)和浓度(c)的乘积成正比。朗伯—比尔定律不仅适用于溶液，也适用于均匀的气体、固体状态，是各类光吸收的基本定律，也是各类分光光度法进行定量分析的依据。朗伯-比尔定律的适用条件：

1)单色光：应选用

max处或肩峰处测定；

2)吸光质点形式不变：离解、络合、缔合会破坏线性关系，应控制条件；

3)稀溶液：浓度增大，分子之间作用增强。吸光系数与摩尔吸光系数朗伯-比尔定律A=kbc中的系数k因浓度c所取的单位不同，有两种表示方式：

(1)若c以g·L-1，b以cm表示时，常数k则以a表示，称为吸光系数，单位为L/(g·cm)。此时，朗伯-比耳定律为：

A＝abc。

(2)若c用mol·L-1，b用cm表示，则k用ε来表示，称为摩尔吸光系数，单位为L·mol-1·cm-1

。这时，朗伯-比耳定律为：

A＝εbc。

ε与入射光波长λ有关，表示ε时，应注明波长。ε和a可通过下式转换：摩尔吸光系数()的讨论

1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性鉴定的参数；

2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；

3）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。

4）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6～10）×104：高灵敏；

ε<2×104：不灵敏。

5）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇配成浓度为0.150mmol

L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数及质量吸光系数a。解：A=εbc得出：ε=A/bc=-lg0.398/2×0.150=1.33×103第三节可见分光光度法

一分光光度计分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框图示意如下光源→单色光器→吸收池→检测器→讯号处理及显示器一、基本组成光源单色器样品室检测器显示1.光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。

2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。3.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理第三节可见分光光度法二、测定方法

可见分光光度法常用于定量测定，根据Lambert-Beer定律，在一定波长条件下，吸光度与浓度成正比，因此在分光光度计上测出吸光度，通过下列方法即可求出被测物质含量:第三节可见分光光度法1.标准曲线法在测定溶液吸光度时，为了消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面对光的反射等与被测物吸收无关的因素的影响，必须采用空白溶液(又称参比溶液)作对照。常用的空白溶液有下列三种。①溶剂空白②试剂空白③试样空白

选择适当的参比溶液参比溶液是用来调节仪器工作零点的，若参比溶液选得不适当，则对测量读数准确度的影响较大。①纯溶剂空白：当试液、试剂、显色剂均在测定波长处无吸收时，可用蒸馏水作参比液，称纯溶剂空白。②试液空白：试剂和显色剂均无色时，而被测溶液中其他离子有色时，应采用不加显色剂的试液溶液作参比液，称试液空白。③试剂空白：试剂和显色剂均有颜色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后把显色剂、试剂均按试液测定方法加入，以此做参比溶液，称试剂空白。

标准曲线的绘制及应用a、标准曲线配制一系列已知浓度的标准溶液，在确定的波长和光程等条件下，分别测定系列溶液的吸光度A，然后以吸光度为纵坐标，以浓度c为横坐标作图，得到一条曲线，称标准曲线，也称做工作曲线。b、标准曲线的应用

(1)曲线的斜率为

b，由于b是定值，由此可得到摩尔吸收系数

；

(2)根据未知液的Ax，在标准曲线上查出其浓度cx。AcAxcxκb标准曲线第三节可见分光光度法2.标准对照法先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度用cs表示)，在

max处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：cx=csAx/As

吸光度的测量与吸光度的加和性1、吸光度的测量用参比溶液(referencesolution)调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。2、吸光度的加和性吸收定律能够用于彼此不相互作用的多组分溶液。它们的吸光度具有加合性，且对每一组分分别适用，即：A总=A1+A2+A3…+An

=ε1bc1+ε2bc2+ε3bc3…+εnbcn第四节

提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差分光光度法的误差主要来自以下几方面：1.溶液偏离Beer定律引起的误差测定条件：均匀稳定的稀溶液，单色光。2.仪器误差，A为0.2～0.7,误差较小。3.主观误差。

第四节

提高测量灵敏度和准确度的方法二选择合适的显色剂条件：

1.灵敏度

2.选择性高

3.生成的有色物质有确定的组成

4.生成的有色物质要稳定

5.显色剂在测定波长处无明显吸收。

第四节

提高测量灵敏度和准确度的方法三、选择合适的测定条件

1.波长的选择（入max）；

2.显色剂的用量要适量；

3.酸度（A–pH曲线）；

4.显色时间（A–t曲线）；

5.溶液浓度控制在A=0.2~0.7范围;

6.掩蔽干扰离子。

第五节紫外分光光度法简介

一、751-G型分光光度计二、紫外分光光度法的应用1.定性鉴别比较

max、

(

max)或a(

max)比较吸光度(或吸光系数的比值)2.定量测定3.有机化合物的结构研究第五节紫外分光光度法简介例已知维生素B12的α(361nm)=20.7L

g-1

cm-1。精密称取样品30.0mg，加水溶解后稀释至1000ml，在波长361nm处用1.00cm吸收池测得样品的吸光度为0.618，计算样品溶液中维生素B12的质量分数。解

所测样品溶液中维生素B12的质量浓度：本章小结分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。