抗体酶的研究与应用

抗体酶的研究进展摘要：抗体酶是具有催化活性的IgG（免疫球蛋白）。由于它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性，因此抗体酶制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途。文章综合介绍了抗体酶的来源、提取与分离纯化方法、分子修饰、固定化技术、应用及研究的最新进展等。关键词：抗体酶、来源、提取与分离、分子修饰、固定化技术、应用AdvanceintheResearchofAbzymeAbstract:Abzymesisakindofimmunoglobulinwithcatalytic.Becauseithashighselectivityandamazingdiversityasantibodiesandhighlycatalytic,itisanticipatedthatusingabzymespreparationtechnologyonecanobtainanykindoftailor-madebiocatalysts,includingthosenotoccurredinnature,forvariouskindsofpracticalapplication.Thisarticlesummarizestheresourceextractionandseparation,moleculemodifying,technologyofimmobilization,theapplicationsandtheresearchstrategiesoftheabzymes.Keywords:abzymes;resource;extractionandseparation;moleculemodifying;technologyofimmobilization;applications抗体酶的来源与方法抗体酶的来源可以运用多种方法来设计和制备，主要有诱导法、工程抗体催化法、克隆免疫反应因子基因法、拷贝法、化学修饰法、细胞融合法等多种方法，其中尤以前两种方法的应用最为普遍。1.1诱导法这是抗体酶的传统制备方法，选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物，与载体蛋白偶联后免疫动物，使宿主产生抗体，再利用杂交瘤技术来筛选和分离，得到具有催化活性的单克隆抗体，就是抗体酶。用单克隆化的杂交瘤细胞就能进行单克隆抗体的扩大生产。由于多数反应过渡态类似物的分子量较低,即半抗原本身的免疫原性很弱，必须与某种载体偶联才能表现免疫原性。目前最常见的载体蛋白包括牛血清蛋白和钥孔血蓝蛋白等。所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大程度上取决于反应过渡态类似物,即半抗原的设计要求通过半抗原的设计,产生最优化的抗体催化剂,实现与免疫球蛋白结合口袋的互补现已应用的设计策略包括:过渡态类似物设计、诱导和转换设计、反应免疫、“潜过渡态”半抗原设计等。1.2工程抗体催化法工程抗体催化法借助基因工程和蛋白质工程技术，对抗体进行改造，引入催化活性将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列，以获得高效的抗体酶。目前，定点突变的方法已成为提高抗体酶活性的一种常规方法。此外，对抗体结合口袋中的氨基酸残基进行随机突变，再用合适的体外筛选方法，就可获得高活性的抗体。随着噬菌体抗体库技术的完善。可根据需要构建适当序列的基因片断，绕过免疫学方法，构建全新的抗体酶。在此基础上，人们又发展了噬菌体展示技术，这种技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功能性表达，与高效快速的筛选手段结合起来，彻底改变了抗体酶生产的传统途径。用工程抗体催化法生产抗体酶，不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞，并且可筛选具有特定功能的未知结构，具有生产简单、价格低、抗体的免疫原性较低的优点,并易获得稀有的抗体。1.3克隆免疫反应因子基因法通过PCR技术克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因，建立单独产生重链和轻链的噬菌体文库。然后再通过每个载体中存在的非对称限制位点使它们随机地将基因的轻重链结合。这些含有上百万个高水平表达的轻链和重链片段的文库在大肠轩菌中表达和组装，通过这种方法可从上百万种可能性中选择抗体酶。1.4拷贝法用已知的酶作为抗原免疫动物，通过单克隆技术，制得该种酶的抗体。以此种抗体免疫动物，再次采用单克隆技术，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活性的催化抗体。因为抗原和由其诱导产生的抗体具有互补性，经过二次拷贝后，就把原来酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上，使该抗体酶具有高选择性地催化原酶所催化的反应的能力。1.5细胞融合法基本过程如下：利用能产生抗体的脾脏细胞与能在体外无限增值的骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体，又能在体外无限增殖。通过选择培养，过滤掉脾脏细胞与骨髓细胞，使杂交细胞得以存留。将杂交体克隆化，即繁殖成母体的同一细胞或分离成菌落，这些菌落能够产生单一均匀的抗体。对这些菌落用酶联免疫吸收实验加以筛选，以评价其选择性结合抗原的能力。然后把抗原结合到一种固体支撑物上，再加入含有抗体的介质，这样抗原－抗体复合物随即形成，经过提纯就得到AB－AC复合物。抗体酶的提取与分离纯化方法酶的提取与分离纯化是酶生产中最早采用并一直沿用至今的的生产方法，在使用其他方法进行酶的生产过程中也必须进行酶的提取与分离纯化。主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。2.1.细胞破碎方法（1）机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法、研磨法、匀浆法。（2）物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。如温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法。（3）化学破碎法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。（4）酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。2.2.抗体酶的提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。方法有：2.2.1．盐溶液提取抗体酶属于蛋白酶，溶于水。而且在低浓度的盐溶液中酶的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。当盐浓度达到一定界限之后，酶的溶解度随着盐浓度的升高而降低，这称为盐析现象。一般使用稀盐溶液进行酶的提取。在提取过程中要特别注意温度、pH、提取液的体积。一、提取时温度对酶的提取效果有明显影响。一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶的酶分子的扩散速度。但是温度过高往往会引起酶的变性失活，所以提取温度不宜过高；二、溶液的pH对酶的溶解度和稳定性有显著影响。酶分子中含有各种可离解基团，在一定条件下，有的可以离解为阳离子，带正电荷。有的可离解为阴离子，带负电荷，在某一特定的pH条件下，酶分子上所带的正、负电荷相等，净电荷为零，此时的pH为酶分子的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应尽量避开等电点以提高酶的溶解度，同时pH不宜过高或者过低，以免引起酶失活；三、增加提取液的体积可以提高酶的提取率。但是过量的提取液会使酶的浓度降低，对进一步分离纯化不利。所以提取液一般为原材料也的3-5倍，最好分几次提取。此外，在酶的提取过程中，含酶原料颗粒体积越小则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌可以使提取液中的酶分子离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速度；若适当延长提取时间，可以使更多酶溶解出来，直至平衡。2.2.2．ELISA法由于抗体酶具有抗体的性质，因此还可以用ELISA法（酶联免疫吸附剂测定法）来提取。ELISA法实质上是间接免疫法，使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。然后用该标记酶与第一抗体特异性结合，从而显示其位置。本方法所得到的抗体酶的催化能力的高低，在很大程度上取决于化学模型物的设计，现在应用的设计策略包括：诱导和转化设计，反应免疫，“潜过渡态”半抗原设计等等。抗体酶的分子修饰酶的结构决定性质，改变结构就影响了性质。这就是酶的分子修饰原理，即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。抗体酶的分子修饰也是如此。由此，酶分子修饰的方式（核酶除外）可以从蛋白质一级结构、二级结构、三级结构和四级结构进行。换言之，也就是酶分子的主链修饰、侧链基团修饰、组成单位置换修饰和酶分子的物理修饰。抗体酶由于具有酶和抗体的性质，因此抗体酶的分子修饰主要是在四级结构上。过程如下：生物体受抗原诱导产生的具有催化能力的抗体，其在结构上与抗原高度互补并能与之特异结合。通过设计化学反应过渡态或中间体类似物作为半抗原，诱导机体产生抗体，产生的抗体能特异性地识别过渡态分子，降低反应的活化能，达到催化反应的目的。抗体酶和所有的抗体一样，都是由两条轻链和两条重链构成，抗原与轻链和重链的可变区特异性结合，因此可变区的氨基酸的排列顺序决定了抗体分子的特异性，其本质是一类具有催化活性的免疫球蛋白，可变区赋予其酶的属性，所以也称为催化抗体。单一模拟物(半抗原)诱导产生的多种催化抗体，其轻重链可变区具有高度同源性，氨基酸序列的不同表现为亲和力高低及催化能力大小的差异。按照酶的过渡态学说，抗体酶可能是通过可变区与过渡态结合并使之稳定，提供易化旁路，从而加速反应的进行，有人认为轻链主要介导催化活性，而重链主要起结合作用和调节动能，其中影响活性的区域主要是CDR3区。抗体与酶都是蛋白质，且都能高度选择性地与靶分子结合，但酶的种类仅有几千种，而抗体的种类可达千万种以上。抗体酶的发现打破了只有天然酶才有分子识别和加速催化反应的传统观念，为酶工程学开创了新的领域。抗体酶可催化趋向性反应及非趋向性反应，后者可能分为两种情况：一是在放热分解反应中控制反应构象，使多产物反应转变为单产物生成为主的反应；另一种情况是降低反应中过渡态能障。但抗体酶缺少天然酶的韧性或扭曲性，没有天然酶所具的底物去稳作用，而可能只起稳定过渡态的作用。抗体酶的固定化技术固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上或用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。固定化酶具有如下性质：（1）最适pH值发生改变；（2）最适温度有所提高；（3）酶的活性和催化底物有所变化。但是固定化酶通常只能用于胞外酶的生产，对于胞内酶采用固定化会使分离纯化更加复杂。常见的固定化酶的方法有：吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法。抗体酶主要用载体结合法。最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。5抗体酶的应用及工业化方面5.1在医学领域的应用随着对抗体酶研究的深入，抗体酶越来越显示出其在医学领域中的潜在应用价值。主要有以下几个方面：一，利用抗体酶催化药物在体内的还原，有利于机体对药物的吸收，并降低药品的毒副作用；二，将抗体酶技术和蛋白质融合技术结合在一起，设计出既有催化功能又有组织特异性的嵌合抗体，用于切除恶性肿瘤；三，将抗体酶直接作为药物，以治疗酶缺陷症患者。人们除了对抗体酶用于治疗可卡因成瘾性、有机磷毒剂的解毒等实际问题进行研究外，同时，又发展了一些诸如定向抗体酶前药治疗法。前药是指为降低药物毒性而设计的一类自身无活性或活性较低，需要在体内经代谢转化为活性药物以发挥作用的化合物。抗体酶在正在发展的ADEPT体系中成功的对前药进行活化，提高了肿瘤治疗的选择性，显示出很好的应用前景。将能催化前药转化为肿瘤细胞毒剂的酶，与肿瘤细胞专性抗体相偶联，酶通过与肿瘤抗体的结合而存在于肿瘤细胞表面，当前药扩散至肿瘤细胞表面或附近时，抗体酶就会将前药迅速水解，释放出抗肿瘤药物。这样大大提高了肿瘤细胞附近局部药物的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤力，减少对正常细胞的杀伤作用。经科学家们的不断努力，抗体酶在癌症方面的应用将日益完善，有可能成为肿瘤治疗的重要武器。5.2在戒毒领域的应用吸毒是一个困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上瘾后很难戒掉，直接拮抗可卡因上瘾的抗体至今还没有找到。一个替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子，然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生，必须使用高剂量的抗体使这一应用受到限制。抗体酶则不一样,不但能和抗原结合，而且能使抗原水解而再生，这不但能减少抗体酶的用量，也能减少抗体酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用前景更好。Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。5.3在有机合成领域的应用复杂天然产物的合成一直是有机合成中的热点之一。目前，已经成功筛选出可催化六种类型酶促反应和几十种化学反应的抗体酶，可催化许多困难和能量不利的反应。催化类型主要有以下：底物异构化反应、酯水解、酰胺水解、酰基转移、Claisen重排反应、光诱导反应、氧化还原、消除反应，金属螯合、环化反应等。抗体酶还可以作为手性助剂控制光加反应产物的立体化学，用于手性化合物的拆分，还可用于探索化学反应机制。5.4在前药设计中的应用前药(prodrug)又称前体药物或药物前提，是指药物某一基团在体外经选择性保护，然后在体内特定病灶部位脱保护而发挥治疗作用的一类药物。抗体酶的制备原理可用于前体药物设计和活化。6.抗体酶的未来展望未来对抗体酶的研究重点集中在三个方面：1.通过制定催化活性实现对特定化学反应的催化，实现对那些不能用天然酶催化的反应的催化。2.抗体酶体内治疗作用的拓展。3.抗体酶生产库以及生产技术的研究，使抗体酶能降低成本，实现商业化应用。随着蛋白质工程，基因工程，免疫学等生物技术的不断发展，抗体酶的研究将会有更大的突破和广泛的应用前景。总之，抗体酶是化学和生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物，是抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的一种新策略。虽然抗体酶的研究存在很多不足之处，但相信通过多学科的交叉协作，随着单克隆抗体技术的发展和酶的作用机制的阐明，抗体酶的研究必将达到一个新的水平，一定会结出更加令人振奋的成果。参考文献：［1］洪维剑，蔡发国．抗体酶就的新进展．饲料研究，2009，10:15［2］范立梅，阮红．抗体酶的研究及应用［J］．温州大学学报，2005，18(4):51—54．［3］SuzukiH．Ｒecentadvancesinabzymestudies．J．Bio