第三章 基因工程（预测题）

学而优·教有方PAGEPAGE1第三章基因工程命题猜想+考题测试考点一：DNA的粗提取及鉴定考点二：DNA重组技术考点三：基因工程的基本操作程序考点四：基因工程的应用考点五：蛋白质工程的原理和应用考点一：DNA的粗提取及鉴定1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（

）A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水C．粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质D．将粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂DNA被染成蓝色2．在利用洋葱进行“DNA的粗提取和鉴定”的实验中，相关操作正确的是（

）A．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNAB．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度C．向DNA滤液中加入等体积、预冷的50%酒精，以获得DNA粗提物D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应3．如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是（

）A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大4．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10g。剪碎后分成两组，一组置于20

℃、另一组置于－20℃条件下保存24h。（1）将DNA的粗提取物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入试剂，在条件下进行鉴定，结果如下表：材料保存温度花菜辣椒蒜黄20℃＋＋＋＋＋＋－20℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋注：“＋”越多表示蓝色越深。（2）该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同对DNA提取量的影响”。（3）根据实验结果分析：①结论1：与20℃相比，相同实验材料在－20℃条件下保存，DNA的提取量更(填“多”或“少”)。结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从中提取的DNA量最多。②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了的活性，DNA降解速度减慢。5．DNA粗提取和鉴定【实验原理】①DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在中的溶解度不同，在mol/L下，DNA的溶解度最小；同时DNA不溶于，但是细胞中的某些蛋白质可以溶解其中。②DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：【实验材料】动物细胞选择（填“羊成熟的红细胞”或“鸡血细胞”），原因是【实验步骤】①破碎细胞：鸡血细胞液加入，同时用玻璃棒搅拌；切碎的洋葱中加入。然后收集滤液。②去除滤液中的杂质：先在滤液中加入mol/L的NaCl，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液的浓度至mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，最后用mol/L的NaCl溶解DNA。③DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入的酒精溶液（体积分数为），静置2~3min。④DNA的鉴定：用mol/L的NaCl溶解DNA；在条件下，DNA与反应呈现。【注意事项】①为防止血液凝固，需要向血液中加入。②二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。考点二：DNA重组技术6．某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ处理，则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如表所示。下列叙述不正确的是（

）限制酶名称识别序列及切割位点BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATCA．上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端B．该DNA分子上有两个BamHⅠ的酶切位点C．黏性末端能通过T4DNA连接酶连接D．若用两种酶共同处理，会形成6个大小不同的DNA片段7．已知限制酶BamHI和BglⅡ的识别位点分别是-G↓GATCC-、-A↓GATCT-。下列有关说法错误的是（

）A．限制酶的识别序列可能由4个、6个、8个或其他数目的核苷酸组成B．上述两种限制酶切割出的末端只能用E.coliDNA连接酶进行“缝合”C．上述两种限制酶切割出的末端之间相互连接后可能不会再被两种限制酶识别D．若用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，可提高重组质粒构建的成功率8．“基因编辑婴儿”露露和娜娜的诞生引发了巨大的争议。基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对基因中特定DNA片段的敲除、加入等。请回答下列有关问题：（1）露露和娜娜的诞生借助了试管婴儿技术，包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术。精子需经过处理才能与发育至期的卵子结合形成受精卵，当受精卵最早发育至阶段时，可移植到母体子宫中继续发育。（2）露露和娜娜的CCR5基因中被敲除了32个碱基对，使得T细胞不能正常表达某种膜蛋白，从而使HIV无法识别并攻击T细胞。敲除CCR5基因中32个碱基对，类似于酶的作用，敲除后产生的DNA片段末端通常有两种形式即，并通过酶连接起来。（3）基因编辑技术引起的变异属于。考点三：基因工程的基本操作程序9．PCR扩增仪的温度、时间和循环次数等参数设定不当会影响到基因的扩增结果。下图是PCR扩增目的基因时的参数设定，图中线上、线下分别为温度和时间设定。下列叙述错误的是（）A．步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量B．步骤3的温度及时间设定主要依据引物的长度及G、C含量C．步骤4延伸时间的设定主要依据目的基因的碱基数目D．步骤5除设定循环次数（25次）外，还应将“GOTO”设定为步骤310．用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（）A．用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶A的酶切位点C．电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关D．设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR11．为探究M基因的功能，科研人员利用基因工程技术将M基因导入拟南芥中，培育出转M基因拟南芥植株，相关流程如图所示，其中b过程利用了PCR技术。下列相关叙述错误的是（

）A．a、b过程中所需要的酶分别是逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶B．b过程中将温度降至50℃左右的目的是将双链DNA解聚为单链C．e过程中，Ti质粒的T-DNA可携带着M基因转移到拟南芥细胞中D．获得的转M基因拟南芥植株自交，子代可能会发生性状分离12．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片断。下列有关说法不正确的是（）A．PCR退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关C．选取引物甲丙，扩增出450bp长度片断时，可以说明目的基因正接D．选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接13．在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法:In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列），然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（

）A．推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列14．HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是（

）A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRI的识别序列C．利用PCR技术扩增目的基因时，退火温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法15．单个B细胞抗体技术可用于制备高亲和力、高特异性的单抗，其技术流程如下：①康复者单个B淋巴细胞的分离和筛选；②利用RT-PCR获取和扩增抗体基因；③构建基因表达载体；④将抗体基因导入动物细胞；⑤单抗的筛选和鉴定。下列叙述错误的是（）A．操作①选用单个B淋巴细胞以保证最终获得纯度较高的单抗B．操作②使用的PCR反应体系常添加Mg2+以激活DNA聚合酶C．操作③常用两种限制酶切割抗体基因和载体以防止其自身环化D．操作④前可用Ca2+处理受体细胞促使其主动吸收DNA分子16．载体是基因工程中携带外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是培育转基因抗虫棉基本流程示意图，相关叙述正确的是（

）A．重组载体A、重组载体B分别是基因表达载体和基因克隆载体B．基因克隆载体可使目的基因在受体细胞中稳定存在C．必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间D．细菌B可能是大肠杆菌17．东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（

）A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞18．在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生产植物疫苗时存在的问题之一。研究表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人员拟构建含有两个35s启动子（35s启动子是花椰菜花叶病毒的一种强启动子）串联的转基因苜蓿。一个35s启动子包括1个A区和2个B区。图甲表示35s启动子及其附近区域分布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待转入第二个35s启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。（1）利用PCR技术可以扩增35s启动子，PCR技术的原理是，此技术设计引物很关键，引物是。利用此技术扩增的35s启动子可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用来鉴定PCR的产物。（2）根据限制酶识别位点，为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择限制酶切割图甲的DNA片段。（3）为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是、，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是（填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能。平板类型①②③甲：无抗生素+++乙：卡那霉素--+丙：？-++丁：？--+19．健康的生活方式、乐观的心态和定期体检是预防癌症的主要手段。（CAR-T细胞疗法是治疗血液恶性肿瘤及淋巴瘤的研究热点，我国首款新型肿瘤治疗方法——CAR-T产品于2021年上市。左图为CAR-T细胞疗法的原理示意图，该疗法借助基因工程和细胞工程技术，根据CAR蛋白（右图）是多种肿瘤的嵌合抗原受体的特点而设计。回答下列问题：（1）机体肿瘤的发生主要与免疫系统的功能降低有关。（2）图中过程①称为，这是基因工程的核心步骤，需要用到的工具酶有。过程②最常用的方法是。CAR-T细胞输入患者体内后，其活化需要两个信号的刺激，具体是。（3）据图可知，CAR-T细胞疗法相对传统的药物化疗和放疗而言，具有（请写出两点）的突出优点。（4）CAR-T细胞在治疗肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的总体效果上还不尽如人意，请根据右图并结合特异性免疫的原理，提出一种CAR蛋白改造的简单思路，以提升CAR-T细胞对实体瘤的疗效：。20．基因工程技术在动物科学领域有广泛应用，其中嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）技术是一种新兴的免疫疗法，用于治疗某些癌症。简要流程是：先从患者体内分离出T细胞，利用基因工程技术将能识别肿瘤抗原的抗体基因与T细胞的受体基因拼接，再将拼接的基因导入T细胞，体外扩增后回输到患者体内。请回答下列问题：（1）基因工程的核心步骤是，该过程需要的工具酶是。（2）在目的基因的首端和尾端需分别加上启动子和终止子，启动子是识别和结合部位，终止子则起到的作用。为保证目的基因被顺利切割，限制酶切割位点应加在PCR引物的（填“3”或“5”）端。（3）在体外扩增T细胞需要加入细胞培养液，该培养液通常含有（至少填3种）等物质。此外，气体环境也是细胞培养的重要条件，所需气体主要有。（4）CAR-T细胞在患者体内能与肿瘤细胞密切接触，并使其裂解死亡。该事实说明细胞膜具有的功能。（5）简述CAR-T细胞免疫疗法相比传统化疗在治疗癌症时的优势：。（至少答出两点）考点四：基因工程的应用21．玉米（2N=20）的传统育种方式是杂交育种。现代农业中，单倍体育种、诱变育种、基因工程育种都是玉米育种的重要技术。下列叙述错误的是（）A．单倍体育种一般需要经过脱分化和再分化过程B．诱变育种形成的新性状有可能稳定遗传C．基因工程育种能定向改变玉米性状D．杂交育种较诱变育种操作简便，一定能快速得到所需新品种22．利用基因工程技术使哺乳动物成为乳腺生物反应器，以生产所需要的药品，如转基因动物生产人的生长激素。科学家培养转基因动物成为乳腺生物反应器时，下列说法错误的是（

）A．利用显微注射法将人的生长激素基因导入受体哺乳动物体内B．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起C．动物必须是雌性才能满足要求D．动物需要进入泌乳期才能成为“批量生产药物的工厂”23．基因编辑是一种基因工程技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以实现对DNA的定点切割，其工作原理如下图所示，向导RNA引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点并剪切DNA。研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，下列说法错误的是（

）A．细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶B．可通过CRISPR/Cas9技术敲除突变基因根治猫叫综合征等遗传病C．Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNAD．Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA长度的延长而增加24．Ⅲ型胶原蛋白，是人体皮肤、筋膜、肌腱中主要的胶原蛋白。Ⅲ型胶原蛋白不仅是许多器官必不可少的结构成分，还可通过与血小板结合而促进血小板聚集，因此在凝血中起重要作用。家蚕丝腺生物反应器是利用家蚕丝腺表达重组蛋白的转基因动物表达系统。家蚕已丧失飞翔逃逸能力，家蚕幼虫丝腺具有强大的蛋白质合成与分泌能力。科学家已成功利用家蚕丝腺生物反应器生产Ⅲ型胶原蛋白，回答以下问题：（1）科学家将Ⅲ型胶原蛋白基因与等调控元件重组在一起，通过的方法导入家蚕的受精卵。（2）从转基因产品的安全性角度分析，家蚕作为外源基因的受体，安全性较高，是因为。（3）科学家曾用大肠杆菌作为工程菌生产Ⅲ型胶原蛋白，流程如图所示：①选取的皮肤细胞为生命力旺盛的新生细胞，原因是。②要将成功转入Ⅲ型胶原蛋白基因的工程菌筛选出来，所用的方法是在培养基中添加。（4）对比工程菌大肠杆菌，利用家蚕丝腺生物反应器生产Ⅲ型胶原蛋白的优势在于，因而使Ⅲ型胶原蛋白具有生物活性。考点五：蛋白质工程的原理和应用25．生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列有关叙述正确的是（

）①由于外植体在植物组织培养过程中不感染病毒，用任何外植体都可制备脱毒苗②由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用③胚胎移植作为胚胎工程的前端技术环节，推动了胚胎工程其他技术的研究和应用④PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，而后常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物⑤利用基因工程技术的乳腺生物反应器，可以让哺乳动物批量生产相应的药物⑥蛋白质工程仅以蛋白质结构为基础逆中心法则进行，就可以改造或制造新的蛋白质A．①③ B．②④⑤ C．②③④⑥ D．①③④⑤⑥26．科学家利用基因定点突变技术，对枯草杆菌碱性蛋白酶BAPB92第188、239和262位氨基酸残基进行改造，构建了突变体BAPB92（A188P）、BAPB92（Q239R）和BAPB92（A188P/V262I）。相对于野生型，BAPB92（A188P）酶活力提高了2.6倍，BAPB92（Q239R）酶活力提高了2.5倍，BAPB92（A188P/V262I）酶活力提高了3.3倍，并且突变体蛋白酶的热稳定性和耐碱情况均得到较大提高。下列相关叙述正确的是（）A．碱性蛋白酶BAPB92的改造无需设计蛋白酶突变体的结构B．水解替换酶BAPB92第188位的氨基酸可获得突变体BAPB92（A188P）C．枯草杆菌碱性蛋白酶的改造工程遵循的原理是基因重组D．三种突变体中BAPB92（A188P/V262I）降低反应活化能的效果最显著27．蛋白质工程是新崛起的一项生物工程，又称第二代基因工程。下图为蛋白质工程的流程。下列有关叙述错误的是（）A．蛋白质工程就是根据人们需要，直接对蛋白质进行加工改造B．蛋白质工程是通过基因改造或基因合成等方法，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质C．①②过程为转录和翻译D．蛋白质工程是从④开始的28．甜味蛋白是一类具有甜度高，热量低等特性的天然甜味剂，有望经生物技术改造和量产后能广泛应用于食品，饮料，药品生产等。莫内林最初是从一种西非植物的浆果中分离提纯到的甜味蛋白，甜度是蔗糖的3000倍左右。图示利用大肠杆菌生产莫内林，其中M基因可表达合成莫内林。表是为PCR扩增M基因设计的引物，画线部分是所需使用的限制性内切核酸酶的识别序列。引物15’GGAATTCCATATGGGCGAATGGGAAATTATCG3’引物25’TTTGGATCCTTACGGCGGCGGAACCGGAC3’（1）引物1的结合位点可能在（选填图中的编号）。画线部分的序列在A中（有/没有），在B中（有/没有）。（2）已知C中的培养基成分有水、酵母粉、蛋白胨和氯化钠，并按一定比例添加氨苄青霉素。将C中有生长优势的菌落经扩大培养后作为菌种在发酵罐中培养，积累产物，以下操作合理的是。A．发酵罐和培养基需严格灭菌B．发酵罐中培养基成分可去掉氨苄青霉素和琼脂C．为避免杂菌污染，培养过程中不能补充培养基D．培养过程中，只需合理控制好温度和pH为了探究莫内林对血糖浓度的影响，将上述大肠菌生产的莫内林配制成与20mg/L蔗糖溶液等甜度阈值的浓度胃灌空腹小鼠，得实验结果如图（a），另用不同浓度的莫内林溶液胃灌空腹小鼠，实验结果如图（b）（3）结合相关信息和所学知识，分析实验可知。A．莫内林可升高血糖，不适宜作为代糖B．与蔗糖相比，莫内林升血糖的效果不显著C．莫内林和蔗糖元素组成相同，因此可转化为血糖D．一定范围内，莫内林对血糖的影响不随其浓度显著变化（4）通过大肠杆菌生产的莫内林甜度较天然莫内林大为降低，天然莫内林也易因温度等降低甜度甚至甜味消失，请结合所学知识和利用相关的生物技术，分析两种莫内林甜度降低的原因并提出进一步改进的工程思路。限时：60分钟一．单选题（3分×15）1．CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，SgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（）A．Cas9蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键B．向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸C．CRISPR/Cas9基因编辑技术有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA序列越长，脱靶率越低D．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和相同的sgRNA进行基因编辑2．下列有关生物学实验的叙述正确的是（

）A．将粗提取出的DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝B．在紫色洋葱鳞片叶外表皮的不同部位观察到的质壁分离程度可能不同C．用显微镜观察洋葱根尖装片时，需保持细胞活性以观察有丝分裂过程D．检测酵母菌细胞呼吸产物时，加入酸性重铬酸钾溶液出现灰绿色，说明一定有酒精产生3．下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（

）A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E．coliDNA连接酶相互连接B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成D．SmaI切割后产生的是黏性末端4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是（

）A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水C．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝D．向洋葱研磨液的上清液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物5．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。下列关于基因表达载体及其构建的叙述，错误的是（）A．用两种限制酶分别切割目的基因和质粒构建表达载体，比用一种限制酶效果更好B．用两种限制酶切割目的基因和质粒之后，也要用两种酶即DNA连接酶、DNA聚合酶进行连接C．构建基因表达载体时，插入目的基因不能破坏标记基因、启动子、终止子等结构的完整性D．基因表达载体包括启动子、终止子、复制原点、标记基因、目的基因等组成部分6．研究发现，植物的抗寒性是累积性的数量性状，由多种抗寒基因调控。如图是蒺藜苜蓿体内的部分抗寒基因在冷驯化过程中的相对表达量，下列有关分析正确的是（

）A．植物的抗寒性说明基因与性状之间是一一对应的B．本实验的自变量是蒺藜苜蓿冷驯化的时间和温度C．为提高蒺藜苜蓿的抗寒性，宜进行5～24h冷驯化D．通过检测细胞内mRNA的合成量就能得出抗寒基因的表达量7．科学家从某植物中提取乙烯受体基因（Ers1），通过基因工程技术将Ers1基因反向连接到质粒中，筛选出转入反义Ersl基因的该种植物，其果实的储藏期将延长，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（

）A．PCR扩增时，需在Ers1基因左右两端分别添加XhoI、HpaI酶切序列B．筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素，过程④包括脱分化和再分化C．转基因植物中反义Ersl基因和Ersl基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补D．若目的基因成功转入植物细胞中，则可检测到Kanr和hyg的表达产物8．如图是RT-PCR过程示意图，①和②表示逆转录酶催化的逆转录过程，③表示PCR过程。据图分析下列说法错误的是（）A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力B．③过程只需要引物bC．RT-PCR不可直接检测基因表达水平D．RT-PCR可检测某些RNA病毒9．将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因PinⅡ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。如图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的切割位点。下列叙述不正确的是（

）A．目的基因插入到质粒的T-DNA上，才能整合到受体细胞染色体中B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRⅠ和PstⅠC．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素D．转化了的杨树细胞在合适条件下经脱分化即可形成抗虫杨树10．宿主细胞膜表面表达出由侵入病毒基因编码的特异性抗原，从而成为免疫应答的靶细胞。新冠病毒的S蛋白是吸附与入侵的关键蛋白质，S基因突变显著增强了病毒传播性。研究人员将新冠病毒原始毒株(WT)和S基因突变毒株(D614G)按图1实验步骤获取S基因，检测D614G突变株的S蛋白在细胞膜上的表达量，结果如图2所示，下列说法正确的是（

）A．新冠病毒侵入细胞后，S蛋白作为抗原刺激机体产生免疫自稳功能B．步骤③需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶构建表达载体C．步骤④用抗原-抗体杂交技术检测细胞是否转入S蛋白基因D．突变株减少S蛋白在细胞膜的表达量，逃避免疫应答，利于病毒传播11．科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计中，合理的是（）A．基因表达载体中的启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点B．利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA可获得β-珠蛋白基因的编码序列C．常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞D．用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌一定含有β-珠蛋白基因12．下列关于基因工程的叙述，正确的是（

）A．基因工程操作需要使用三种工具酶B．基因工程是在细胞水平上进行操作C．DNA连接酶主要作用于DNA中的氢键D．利用基因工程技术可培育转基因动物13．下列植物育种方式中，不需要采用植物组织培养技术的是（

）A．利用秋水仙素获得三倍体无子西瓜B．利用花药离体培养得到单倍体植株C．利用基因工程培养抗虫的棉花植株D．利用细胞工程培养“番茄—马铃薯”杂种植株14．近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（

）A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因15．T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了酶的耐热性。下列相关叙述正确的是（）A．T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变B．T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造C．该方法得到的T4溶菌酶不需要功能的鉴定D．若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响二．多选题（5分×5）16．下图为基因工程中构建重组质粒的过程示意图，下列有关说法正确的是（）A．EcoRV切制出来的载体P1为平末端B．T4DNA连接酶既可以连接平末端又可以连接黏性末端C．构建基因表达载体用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体等D．天然质粒具备限制酶切割位点，标记基因，即可作为载体17．链霉菌是一种异养需氧型的细菌，为利用链霉菌生产药物A，研究者构建重组DNA并导入链霉菌。重组DNA含启动子P、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因）。培养和筛选过程如下图所示。下列叙述不正确的是（

）A．实验所用培养基需要先调pH再行高压蒸汽灭菌后才能使用B．稀释后涂布时应用涂布器沾取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面C．卡那霉素抗性强弱与药物A基因的表达量呈正相关D．应选用培养基b的菌株进一步鉴定以生产药物A18．孤独症谱系障碍与SHANK3基因的分子缺陷密切相关，我国科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，对猕猴的SHANK3基因进行编辑，首次获得该病的模型猴。CRISPR/Cas9基因编辑系统的Cas9蛋白通过识别特定核苷酸序列、切除SHANK3基因部分序列，使其失去作用。以下说法错误的是（

）A．Cas9是一种限制酶，断开SHANK3基因中特定部位的磷酸二酯键B．自然条件下精子在雌性动物的生殖道内获得受精能力，在子宫中完成受精作用C．对母猴乙注射促性腺激素进行同期发情处理，使其生殖器官的生理变化与母猴甲同步D．对卵母细胞、受精卵、早期胚胎的培养，都需要一定的CO2浓度维持培养液的pH19．下列是通过基因工程对生物体遗传物质进行改造的实例，其中子代能遗传获得该性状的是（

）A．将干扰素基因表达载体导入酵母菌，筛选获得的干扰素工程菌B．将烟草花叶病毒外壳蛋白基因导入烟草体细胞，最终获得的转基因烟草C．将抗凝血酶基因导入羊受精卵，培育出作为乳腺生物反应器的奶羊D．以修饰的腺病毒为载体，将治疗囊性纤维化病的正常基因导入患者肺组织中20．腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述正确的是（

）。A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一B．加入连接肽需要通过改造基因来实现C．获得N1的过程需要进行转录和翻译D．自然界中的酶都可以通过蛋白质工程进行改造三．简答题（15分×2）21．CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。（1）研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过次DNA复制可以完成修复。（2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是。（3）为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。①PCR的一般过程为，在变性之前通常有预变性，其目的是。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有（至少答两点）。②写出His的基因编码链的碱基序列5′3′。③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′3′。22．In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15~20bp），然后用In—Fusion酶（能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端16个碱基，并使其降解）处理即可实现无缝连接。它的操作步骤（如图）大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In—Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：（1）过程①需要用到的酶是，质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为个。（2）过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的好处是。（3）过程④中，用处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和酶，实现完全环化。（4）通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用×100%表示，此结果较真实值偏高。第三章基因工程命题猜想+考题测试考点一：DNA的粗提取及鉴定考点二：DNA重组技术考点三：基因工程的基本操作程序考点四：基因工程的应用考点五：蛋白质工程的原理和应用考点一：DNA的粗提取及鉴定1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（

）A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水C．粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质D．将粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂DNA被染成蓝色1．D【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；B、DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水，且溶解度较高，B正确；C、粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质，因此为了获得纯度较高的DNA需要进一步提纯，C正确；D、将粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可发现DNA被染成蓝色，D错误。故选D。2．在利用洋葱进行“DNA的粗提取和鉴定”的实验中，相关操作正确的是（

）A．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNAB．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度C．向DNA滤液中加入等体积、预冷的50%酒精，以获得DNA粗提物D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应2．A【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性；（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色；2、DNA粗提取和鉴定的过程：（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可，如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜，例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；（3）去除滤液中的杂质；（4）DNA的析出与鉴定：粗提取的DNA与二苯胺试剂，混合均匀后变蓝。【详解】A、研磨洋葱时，加入适量的研磨液作用是瓦解细胞膜，有利于细胞破裂，充分释放核DNA，A正确；B、利用纱布进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度，B错误；C、向DNA滤液中加入等体积、预冷的95%酒精，以获得DNA粗提物，C错误；D、将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL二苯胺溶液，沸水浴，以利于发生颜色反应，D错误。故选A。3．如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是（

）A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大3．D【分析】DNA的粗提取和鉴定的原理是：(1)DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。(2)DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶液酒精。(3)DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。(4)DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。【详解】A、DNA的粗提取和鉴定步骤是：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA的滤液→去除滤液中杂质→DNA的析出→鉴定，因此图中表示正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A错误；B、猪血红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不相同，B错误；C、⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是实验组，C错误；D、步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，D正确。故选D。4．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10g。剪碎后分成两组，一组置于20

℃、另一组置于－20℃条件下保存24h。（1）将DNA的粗提取物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入试剂，在条件下进行鉴定，结果如下表：材料保存温度花菜辣椒蒜黄20℃＋＋＋＋＋＋－20℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋注：“＋”越多表示蓝色越深。（2）该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同对DNA提取量的影响”。（3）根据实验结果分析：①结论1：与20℃相比，相同实验材料在－20℃条件下保存，DNA的提取量更(填“多”或“少”)。结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从中提取的DNA量最多。②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了的活性，DNA降解速度减慢。4．(1)二苯胺沸水浴(2)(保存)温度(3)多蒜黄(核酸水解)酶【分析】DNA粗提取与鉴定的原理（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精．利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离；（3）.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。【详解】（1）鉴定DNA时可用二苯胺试剂，在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。（2）根据表格可知该实验的自变量是温度和不同材料，因此该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同(保存)温度对DNA提取量的影响”。（3）①结论1：与20℃相比，相同实验材料在－20℃条件下保存，与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色更深，说明DNA的提取量更多。结论2：结合表格信息可知，等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多，因此其与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色最深。②出现结论1的原因是低温抑制了(核酸水解)酶的活性，DNA降解速度减慢，因而能获取更多的DNA。5．DNA粗提取和鉴定【实验原理】①DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在中的溶解度不同，在mol/L下，DNA的溶解度最小；同时DNA不溶于，但是细胞中的某些蛋白质可以溶解其中。②DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：【实验材料】动物细胞选择（填“羊成熟的红细胞”或“鸡血细胞”），原因是【实验步骤】①破碎细胞：鸡血细胞液加入，同时用玻璃棒搅拌；切碎的洋葱中加入。然后收集滤液。②去除滤液中的杂质：先在滤液中加入mol/L的NaCl，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液的浓度至mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，最后用mol/L的NaCl溶解DNA。③DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入的酒精溶液（体积分数为），静置2~3min。④DNA的鉴定：用mol/L的NaCl溶解DNA；在条件下，DNA与反应呈现。【注意事项】①为防止血液凝固，需要向血液中加入。②二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。5．不同浓度的NaCl溶液0.14酒精溶液蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响鸡血细胞哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)一定量的蒸馏水一定的洗涤剂和食盐20.142与滤液体积相等的、冷却95%2沸水加热二苯胺试剂蓝色柠檬酸钠现配现用【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。由图可知，DNA的溶解度随着NaCl的浓度不同而不同，当NaCl浓度为0.14mol/L时溶解度最低。【详解】①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。②在0.14mol/L下，DNA的溶解度最小。③DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶解其中。④根据酶的专一性可知，蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，温度过高时蛋白质变性，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。⑤⑥由于哺乳动物成熟红细胞无细胞核（DNA）和众多细胞器，选择鸡血细胞做实验材料。⑦由于动物细胞无细胞壁保护，在鸡血细胞液加入蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，可使鸡血细胞吸水涨破，以便收集DNA。⑧提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，食盐的作用是溶解DNA，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，使DNA从细胞中释放出来。⑨由于在2mol/L的NaCl溶液中DNA溶解度较高，此时可过来出去不溶的杂质。⑩随后将NaCl浓度调到0.14mol/L，此时DNA溶解度将低，可将DNA析出。⑪析出DNA后在用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。⑫⑬由于DNA不溶于酒精溶液，在析出后溶解的DNA溶液中加入与滤液体积相等的95%冷却酒精。⑭-⑰DNA鉴定时，将其溶解在2mol/L的NaCl溶液中，在沸水加热条件下，二苯胺试剂与DNA可产生颜色反应，呈蓝色。⑱柠檬酸钠具有防治血液凝固的作用。⑲二苯胺试剂应现配现用，否则会影响鉴定的效果。考点二：DNA重组技术6．某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ处理，则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如表所示。下列叙述不正确的是（

）限制酶名称识别序列及切割位点BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATCA．上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端B．该DNA分子上有两个BamHⅠ的酶切位点C．黏性末端能通过T4DNA连接酶连接D．若用两种酶共同处理，会形成6个大小不同的DNA片段6．D【分析】限制酶主要从原核生物中分离纯化出来。特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。【详解】A、BamHI和Sau3AI两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC，A正确；B、该DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，经Sau3AI处理后形成4个DNA片段，可知该DNA分子为环状DNA，用BamHI处理后，得到2个DNA片段，说明该DNA分子上有两个BamHI的酶切位点，B正确；C、T4DNA连接酶能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，此外还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，C正确；D、该DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，有2个BamHI的酶切位点，但是BamHI识别序列中包含Sau3AI的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。故选D。7．已知限制酶BamHI和BglⅡ的识别位点分别是-G↓GATCC-、-A↓GATCT-。下列有关说法错误的是（

）A．限制酶的识别序列可能由4个、6个、8个或其他数目的核苷酸组成B．上述两种限制酶切割出的末端只能用E.coliDNA连接酶进行“缝合”C．上述两种限制酶切割出的末端之间相互连接后可能不会再被两种限制酶识别D．若用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，可提高重组质粒构建的成功率7．B【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。【详解】A、不同限制酶识别序列有差异，限制酶的识别序列可能由4个、6个、8个或其他数目的核苷酸组成，A正确；B、上述两种限制酶切割出的末端为粘性末端，能用E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶进行“缝合”，B错误；C、上述两种限制酶切割出的末端之间相互连接后形成的序列为，不会再被两种限制酶识别，C正确；D、若用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，可形成不同的末端，能避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，从而提高重组质粒构建的成功率，D正确。故选B。8．“基因编辑婴儿”露露和娜娜的诞生引发了巨大的争议。基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对基因中特定DNA片段的敲除、加入等。请回答下列有关问题：（1）露露和娜娜的诞生借助了试管婴儿技术，包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术。精子需经过处理才能与发育至期的卵子结合形成受精卵，当受精卵最早发育至阶段时，可移植到母体子宫中继续发育。（2）露露和娜娜的CCR5基因中被敲除了32个碱基对，使得T细胞不能正常表达某种膜蛋白，从而使HIV无法识别并攻击T细胞。敲除CCR5基因中32个碱基对，类似于酶的作用，敲除后产生的DNA片段末端通常有两种形式即，并通过酶连接起来。（3）基因编辑技术引起的变异属于。8．(1)获能减数第二次分裂中8~16个细胞(2)限制性核酸内切（或限制）黏性末端或平末端DNA连接(3)基因突变【分析】基因突变是指基因中碱基的增添、缺失或替换，进而引起了基因中遗传信息的改变，进而产生新基因。表现为如下特点：普遍性：基因突变是普遍存在的；随机性：基因突变是随机发生的；不定向性：基因突变是不定向的；低频性：对于一个基因来说，在自然状态下，基因突变的频率是很低的；多害少益性：大多数突变是有害的；可逆性：基因突变可以自我回复(频率低)。【详解】（1）体外受精时，精子需经过获能处理才能与发育至减数第二次分裂中期的卵子结合形成受精卵。不同动物胚胎移植时间不同，其中人的体外受精胚胎最早可以在8~16个细胞阶段移植。（2）碱基对的敲除相当于将基因进行切割，类似于限制性核酸内切酶的作用，敲除后产生的DNA片段末端通常有两种形式即黏性末端或平末端，并通过DNA连接酶连接起来，通常黏性末端连接起来的成功率更高。（3）基因中碱基对的缺失或增加引起的变异属于基因突变，可见基因编辑技术引起的变异属于基因突变。考点三：基因工程的基本操作程序9．PCR扩增仪的温度、时间和循环次数等参数设定不当会影响到基因的扩增结果。下图是PCR扩增目的基因时的参数设定，图中线上、线下分别为温度和时间设定。下列叙述错误的是（）A．步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量B．步骤3的温度及时间设定主要依据引物的长度及G、C含量C．步骤4延伸时间的设定主要依据目的基因的碱基数目D．步骤5除设定循环次数（25次）外，还应将“GOTO”设定为步骤39．D【分析】PCR原理：在高温的作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。【详解】A、步骤2是变性过程，是在高温条件下使DNA分子解旋的过程，由于G和C之间有3个氢键，热稳定性高，故步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量，A正确；B、步骤3是复性过程，一般情况下，引物的长度越长，G和C比例越高，则复性步骤中的复性温度设定就越高，B正确；C、步骤4是延伸过程，时长的设置依据目的基因的长度，即主要依据目的基因的碱基数目，C正确；D、“GOTO”是设置返回的步骤序号，参数应设置为步骤“1”，D错误。故选D。10．用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（）A．用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶A的酶切位点C．电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关D．设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR10．A【分析】限制性核酸内切酶酶切，是一项基于DNA限制性核酸内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性核酸内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。【详解】A、由题可知，图2中三列条带分别对应用A和B两种限制酶同时以及单独使用限制酶A、限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再通过①和②的结果结合图1，分析可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，②是单独使用限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果。限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段最终得到8个游离的磷酸基团，A错误；B、结合图1和图2中第一列A+B酶同时处理的电泳条带结果分析可知，图1中X代表的碱基对数为4500，根据图2中①电泳分离结果存在3500bp长度的条带可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再根据①电泳分离结果存在500bp长度和6000bp长度的条带可知Y是限制酶A的酶切位点，B正确；C、电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关，C正确；D、设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR，D正确。故选A。11．为探究M基因的功能，科研人员利用基因工程技术将M基因导入拟南芥中，培育出转M基因拟南芥植株，相关流程如图所示，其中b过程利用了PCR技术。下列相关叙述错误的是（

）A．a、b过程中所需要的酶分别是逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶B．b过程中将温度降至50℃左右的目的是将双链DNA解聚为单链C．e过程中，Ti质粒的T-DNA可携带着M基因转移到拟南芥细胞中D．获得的转M基因拟南芥植株自交，子代可能会发生性状分离11．B【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。【详解】A、根据图示分析，a过程以mRNA为模板合成DNA，是逆转录过程，需要逆转录酶的催化，b过程为利用PCR技术扩增M基因，该过程需要耐高温的DNA聚合酶催化，A正确；B、PCR过程中，每次循环可分为变性、复性和延伸三步，其中变性是指当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链，复性是指当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误；C、在农杆菌转化法中，将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，T-DNA可携带着目的基因转移到受体细胞中，C正确；D、若获得的转M基因拟南芥植株的细胞中只有一条染色体上含有M基因，相当于杂合子，则其自交会发生性状分离，D正确。故选B。12．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片断。下列有关说法不正确的是（）A．PCR退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关C．选取引物甲丙，扩增出450bp长度片断时，可以说明目的基因正接D．选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接12．C【分析】PCR是利用 DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；D、选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接的话，扩增出来的长度应该是100bp，D正确。故选C。13．在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法:In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列），然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（

）A．推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列13．A【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。【详解】A、分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列），然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、连接磷酸二酯键，不具有形成黏性末端的作用，A错误；B、若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；C、据图可知，重组质粒形成时需要加入In-Fusion酶连接磷酸二酯键，且如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对，C正确；D、分析题意，传统方法常受限于限制酶识别序列，故科研人员研发了新的DNA重组方法:In-Fusion技术，结合图示可知，该技术无需识别特定切割位点，但用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，故需识别目的基因与线性质粒任意同源序列，D正确。故选A。14．HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是（

）A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRI的识别序列C．利用PCR技术扩增目的基因时，退火温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法14．B【分析】基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等；启动子是一段由特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质；终止子位于基因的下游，作用是终止转录，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。【详解】A、图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A正确；B、目的基因两端引入HindⅢ和EcoRI的识别序列，进而使目的基因能够与鸡卵清蛋白基因启动子、载体正确连接，构建基因表达载体，B错误；C、PCR技术扩增目的基因时，若退火温度偏低、则可能导致引物与非目的基因序列部分配对，进而扩增出非目的基因，引物特异性差也会导致和非目的基因序列部分配对，导致产物中出现部分非目标序列，C正确；D、受体细胞为动物细胞时通常采用显微注射法，因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法，D正确。故选B。15．单个B细胞抗体技术可用于制备高亲和力、高特异性的单抗，其技术流程如下：①康复者单个B淋巴细胞的分离和筛选；②利用RT-PCR获取和扩增抗体基因；③构建基因表达载体；④将抗体基因导入动物细胞；⑤单抗的筛选和鉴定。下列叙述错误的是（）A．操作①选用单个B淋巴细胞以保证最终获得纯度较高的单抗B．操作②使用的PCR反应体系常添加Mg2+以激活DNA聚合酶C．操作③常用两种限制酶切割抗体基因和载体以防止其自身环化D．操作④前可用Ca2+处理受体细胞促使其主动吸收DNA分子15．D【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【详解】A、不同的效应B细胞分泌的抗体不同，操作①选用单个B淋巴细胞可以保证最终获得纯度较高的单抗，A正确；B、PCR反应体系中，常加入Mg2+以激活DNA聚合酶，促进PCR延伸中子链的合成，B正确；C、为了防止目的基因和载体自身环化或反向连接，常用两种不同的限制酶去同时切割目的基因和载体，C正确；D、用Ca2+处理细胞，该受体细胞是微生物，需要用Ca2+处理微生物细胞，使其处于感受态，D错误。故选D。16．载体是基因工程中携带外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是培育转基因抗虫棉基本流程示意图，相关叙述正确的是（

）A．重组载体A、重组载体B分别是基因表达载体和基因克隆载体B．基因克隆载体可使目的基因在受体细胞中稳定存在C．必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间D．细菌B可能是大肠杆菌16．B【分析】分析题图：图中重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生BT毒蛋白，因此是基因表达载体。【详解】A、图中重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生BT毒蛋白，因此是基因表达载体，A错误；B、基因克隆载体可使目的基因在受体细胞中稳定存在，并进行增殖，B正确；C、培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A的启动子和终止子之间，C错误；D、大肠杆菌是原核生物，无内质网和高尔基体等细胞器，不能加工BT蛋白，所以细菌B不可能是大肠杆菌，D错误。故选B。17．东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（

）A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞17．C【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基