苹果树腐烂病抗病性鉴定技术规范

1苹果树腐烂病抗性鉴定技术规范本文件规定了苹果树腐烂病抗病性鉴定的术语和定义、接种体制备、鉴定条件和设计、鉴定接种、病情调查、抗性结果、鉴定结果、档案记录。本文件适用于苹果生产过程中腐烂病的抗病性鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1接种体用于接种以引起病害的任何病原物或病原物的一部分。3.2接种悬浮液用于接种的含有定量接种体的液体。3.3接种室指在无菌的环境下进行病原菌种扩繁、转接、接种的房间。4接种体制备4.1病原菌分离从病斑边缘病健交界处剪取0.5cmx0.5cm大小的病组织，用75%乙醇消毒90s，然后用无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干，置于PDA培养基上，28℃恒温培养箱中培养，4℃下保存备用。苹果腐烂病菌的学名、形态特征和分子生物学特征见附录A。4.2接种体繁殖将保存的病原菌在PDA培养基上28℃培养10d～15d，待菌落表面形成分生孢子器。其中，PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。4.3接种体悬浮液制备2用灭菌移植针挑取菌落表面形成的分生孢子器并破碎收集分生孢子，将分生孢子并用无菌水稀释配制成浓度约为1×106个孢子/mL的接种体悬浮液。5鉴定条件和设计5.1接种室接种室为可人工调节湿度、温度和光照等条件，具体室温为25℃、光周期12h光照/12h黑暗、相对湿度35%～40%。5.2鉴定设计鉴定材料随机排列，每份鉴定材料重复3次，每重不低于10个枝条，以红富士健康树枝条接种腐烂病菌为对照。5.3鉴定材料田间采集用于抗性鉴定苹果品种的健康、长势一致、无侧枝2年生枝条，截取长度为150cm并两端蜡封。用自来水冲洗2次，75%酒精冲洗1次，无菌水冲洗1次，自然风干备用。6鉴定接种采用烫伤法接种，用直径5mm的钉帽在在备用鉴定材料上烫伤5个伤口，伤口间距25cm。每个伤口接种10μL接种悬浮液，完成后用保鲜膜包扎烫伤部位，接种4个伤口，1个伤口为对照。将完成接种的枝条扦插在装有细沙的花盆中，置于鉴定室培养。7病情调查7.1调查时间与方法接种后5d调查发病情况，用刀片刮除枝条接种点周围树皮，测量病斑长度。接种苹果腐烂病菌的发病症状描述见附录A。7.2病情级别苹果离体枝条腐烂病病情级别见表1。表1苹果离体枝条腐烂病病情级别0135797.3病情指数计算3病情指数（DI）按式（1）计算。Σ(各病情级别数值×各病情级别的病斑数)调查的总病斑数×病情级别的最高数值Σ(各病情级别数值×各病情级别的病斑数)调查的总病斑数×病情级别的最高数值8抗性结果依据病情指数(DI)的平均值确定不同品种对腐烂病的抗性水平，抗性结果见表2。表2苹果树腐烂病抗性结果病情指数（DI）注：对照感病品种的病情指数DI＞70作为9鉴定结果鉴定结果原始记录表见附录B，鉴定结果报告单按附录C执行。10档案记录将鉴定品种、接种方法、接种日期、调查日期、操作员等内容填表记录，归档并保存2年。抗病性鉴定档案记录表见附录D。4苹果树腐烂病病原菌A.1学名和形态描述A.1.1学名苹果树腐烂病病原学名为苹果壳囊孢（CytosporamaliGrove）、属子囊菌门（Ascomycota）、粪Ehrenb.）。A.1.2形态描述苹果壳囊孢（CytosporamaliGrove）在PDA菌落白色至黄褐色、平展、边缘呈放射状，中央可产生乳白色分生孢子器。分生孢子器扁瓶形，直径为480μm～1600μm。分生孢子单孢、香蕉形、两端圆、微弯曲，大小（3.6μm～6μm）×（0.8μm～1.7μm）。（a）苹果壳囊孢在PDA培养基上的菌落形态图A.1苹果壳囊孢的形态特征A.2分子生物学特征将待提DNA的苹果壳囊孢接种于PDA培养基上，28℃下，光暗交替培养5d，后用灭菌牙签刮取培养基表面菌丝，收集到灭菌的1.5mL离心管中，采用CTAB法提取菌株基因组DNA。以上述基因组DNA为模板，分别以引物对ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b和EF1-728F/EF1-986R（序列见表A1）扩增ITS、β-tubulin和EF1-α基因。ITS引物对ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），β-tubulin引物对Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’）EF1-α引物对EF1-728F（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）和EF1-986R（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）。PCR反应总体系为25μl，各组分如下：10×PCRreactionbuffer2.5μl，10mMdNTP0.5μL，正反引物（浓度为10mM）各0.5μl，1UExTaqDNA聚合酶（TaKaRa，Japan）0.25μL，模板DNA10-20ng，用ddH2O补至25μl。ITS和β-tubulin基因PCR的反应条件一致，为94℃2min预变性；94℃变性60s，退火58℃60s，72℃90s，35个循环；72℃10min。EF1-α的扩增条件为95℃3min5预变性；95℃变性30s，退火55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min。扩增产物用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像仪观察，切胶回收目的基因扩增产物，片段连入PMD18-T载体，进行序列测定，获得序列后中进行系统发育分析。A.3发病症状描述接种苹果壳囊孢后5d后，接种处呈现褐色坏死病斑、病健交界明显、斑易剥离、内部红褐色、酒糟气味，部分品种在接种处出现分生孢子器和分生孢子角。苹果品种抗腐烂病鉴定结果记录苹果品种抗腐烂病鉴定结果记录表见表B.1。表B.1苹果品种抗腐烂病鉴定结果记录表（DI）013579）：