第11章-临床免疫学检验仪器与技术

第十一章

临床免疫学检验仪器与技术

施新明目录第一节免疫荧光分析仪器与技术第二节散射比浊分析仪器与技术第三节

酶免疫分析仪器与技术第四节化学发光免疫分析仪器与技术第五节自动化免疫分析仪的临床应用

重点提示1.自动免疫荧光染色的技术原理是什么？2.时间分辨荧光免疫分析仪的基本原理和性能特点是什么？3.散射比浊仪器的分类和原理是什么？4.比浊法检测抗原过剩的方法有哪些？5.酶联免疫分析技术的原理是什么？6.化学发光酶免疫分析的技术原理是什么？7.吖啶酯化学发光免疫分析技术的原理是什么？8.电化学发光免疫分析技术的原理和特点是什么？9.光激化学发光免疫分析技术的原理是什么？第一节免疫荧光分析仪器与技术一、免疫荧光染色仪器与技术（一）免疫荧光染色技术原理将荧光素标记在抗体上，免疫反应结束后使用特定波长的激发光照射标记的荧光素，荧光素吸收激发光的能量，产生可见的荧光。一、免疫荧光染色仪器与技术（二）免疫荧光染色相关仪器1.免疫荧光染色自动操作仪

用于自动化完成血清稀释、加样、温育、清洗等检测过程。基本结构包含加样系统、清洗系统、温育系统、机械臂和软件系统等。1.条形码扫描器2.样品轨架3.样品针清洗站4.清洗站5.清洗机头6.载片托盘7.试剂架8.用于初始稀释的稀释板9.用于系列稀释的稀释板一、免疫荧光染色仪器与技术（二）免疫荧光染色相关仪器1.免疫荧光染色自动操作仪

加样系统由样品针和清洗站、样品轨架和试剂架等构成；清洗系统包括储液桶、清洗站、清洗机头、废液排除管路等部件；温育系统包括恒温器，孵育盖等；机械臂用于移动样品针、清洗机；特点：①能够替代手工操作，降低操作者的工作强度；②使免疫荧光染色过程标准化，减少人为操作误差；③清洗充分，减少非特异性的干扰。一、免疫荧光染色仪器与技术（二）免疫荧光染色相关仪器2.全自动免疫荧光判读系统（1）技术原理：

DAPI染色使荧光显微镜能够定位细胞；拍摄FITC染色的荧光图像；智能数字荧光图像识别软件进行荧光模型的判读。一、免疫荧光染色仪器与技术（二）免疫荧光染色相关仪器2.全自动免疫荧光判读系统荧光强度判读：软件自动分析荧光图片中的每个像素点的荧光强度，根据荧光强度的数值来判读荧光结果。荧光模型的判读：①模式识别原理计算机系统将图形转化为数字参数，与数据库中存储的大量数据比对，判读荧光模型。需要计算能力强大的计算机；有学习能力，识别能力会随数据库内数据的累积而提高。一、免疫荧光染色仪器与技术②图形识别算法原理；软件系统对阳性结果模拟合成一张三维全息图，测定三维图的峰和谷，转换成数值信息，与软件中设定的条件进行匹配，所需设备简单。一、免疫荧光染色仪器与技术（2）基本结构：主要由全自动荧光显微镜、成像系统、机械与控制系统、计算机和软件系统组成。1、自动荧光显微镜；2、冷CCD摄像头；3、计算机；4、荧光准直仪；5、显微镜控制器；6、LED荧光光源发生器二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术（一）时间分辨免疫荧光分析技术原理镧系元素的荧光寿命比非特异性荧光长，利用这一特点，使用镧系三价稀土离子及其螯合物作为标记物标记抗体（或抗原）进行免疫反应，待反应体系中血清、溶剂和其他成分的短寿命背景荧光完全衰变后，再测量镧系元素的特异性荧光，以有效地降低本底荧光的干扰。这种技术称时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术（一）时间分辨免疫荧光分析技术原理1.解离增强镧系元素荧光免疫分析增强液可使镧系元素形成具有高强度荧光的稳定螯合物。增强液使Eu3+标记的抗体抗原复合物pH降至2～3，有利于Eu3+从复合物上完全解离下来。游离的Eu3+被増强液中的螯合剂所螯合、再与增强液中的β-二酮体生成一个Eu3+在其内部的保护性胶态分子团。新生成的螯合物在紫外光激发下能发射出很强的荧光，信号的增强效果可达上百万倍。2.FIAgen分析系统

用双功能螯合剂4,7-二（氯磺酰基）苯基-1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸，并把生物素-亲和素系统引入TRFIA系统。二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术（一）时间分辨免疫荧光分析技术原理3.酶放大TRFIA采用碱性磷酸酶水解5-氟水杨酸磷酸酯，生成5-氟水杨酸，在碱性条件下5-氟水杨酸可与镧系元素（Tb3+）和乙二胺四乙酸形成强荧光络合物，在激发光源激发下产生荧光。4.均相TRFA系统

利用三联吡啶类化合物将镧系元素（Eu3+）和别藻蓝蛋白连接，组成能量转移效率最高的能量供体和受体对，测量前不必分离结合标记物和游离标记物，可以用双波长时间分辨免疫荧光分析仪直接测定固相荧光。二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术（二）时间分辨免疫荧光分析仪的基本结构二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术（三）时间分辨免疫荧光分析仪的性能特点1.灵敏度高，检测下限可以达到10-18mol/L；分析范围宽，可达4～5个数量级。2.标记结合物稳定，有效使用期长。3.特异性强。4.测量快速，易于自动化，无放射污染。5.不足之处是易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，使检测本底增高。第二节散射比浊分析仪器与技术一、散射比浊法技术原理液相的免疫沉淀反应和散射光谱原理相结合而形成的免疫分析技术。可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，形成免疫复合物从而引起液体浊度的改变，利用散射光谱分析技术测定浊度变化而得知待测抗原的浓度。二、散射比浊技术的分类（一）终点散射比浊法抗原和抗体反应达到平衡，免疫复合物形成的量不再增加，反应体系的浊度不再变化时，可以认为是免疫反应结束。特点：反应过程时间较长，抗体复合物易聚合形成大颗粒沉淀，导致偏低的结果，标本内抗原含量较低时，敏感性不够。主流的散射比浊仪器通常不采用终点散射比浊法。二、散射比浊技术的分类（二）定时散射比浊法由终点散射比浊法改进而成。反应分预反应阶段和反应阶段。预反应阶段用于保证抗原抗体比例合适，避免产生的钩状效应。反应阶段抗原、抗体反应形成不可溶性小分子颗粒，产生的散射光信号，这种信号与待测的抗原量成正比。二、散射比浊技术的分类（三）速率散射比浊法速率散射比浊法是一种抗原抗体结合的动力学测定方法。速率是在单位时间内抗原、抗体结合形成复合物的速度。抗原、抗体结合速率最大的某一时刻称为速率峰，当反应体系的抗体过量时，速率峰的高低与抗原含量成正比。速率散射比浊法动态地测定单位时间内抗原-抗体复合物形成的散射光信号，从而获得多个速率峰，峰值的高低与待测物质（抗原）的量成正比。当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，所出现速率峰的峰值高低代表所测抗原的量。速率散射比浊法具有检测速度快、敏感性高、精确度高、稳定性好的优点。二、散射比浊技术的分类（三）速率散射比浊法二、散射比浊技术的分类（四）乳胶增强免疫比浊法选择一种大小适中、均匀一致的乳胶颗粒，吸附或交联抗体，在液相状态下，单个乳胶颗粒在入射光波长内光线可透过，使透过光增加，散射光量减少；当结合了胶乳颗粒的抗体遇到相应抗原发生聚集时，则使透过光减少，散射光增加，散射光的增加程度与胶乳凝集成正比，也与抗原量成正比。抗体吸附于乳胶颗粒表面可以增加免疫反应复合物的直径，从而增强散射光强度，达到提高散射比浊法检测灵敏度的目的（检测水平可达到ng/ml或pg/ml）。基于单克隆抗体胶乳免疫比浊技术的定量分析是比浊分析技术的发展方向。三、定时散射比浊分析仪的基本结构与性能（一）基本结构BNⅡ散射免疫比浊分析仪由分析仪主机、计算机、键盘、打印机、条形码扫描仪等组成。主要结构包括加样系统，孵育转盘、光路系统和液路系统等。三、定时散射比浊分析仪的基本结构与性能（二）性能特点以定时散射比浊分析法为原理。比浊仪检测器与光路呈13°～24°角测量散射光。使用乳胶颗粒增强技术，提高检测的灵敏度。采用预先反应程序，防止抗原过剩。非特异性反应的排除通过测定反应管起始值和空白值之间的差异，排除样本由于内源性浊度或其有快速反应特性所带来的非特异性干扰。四、速率散射比浊分析仪的基本结构与性能（一）基本结构IMMAGE800速率散射免疫比浊分析仪由分析仪、计算机、打印机三部分组成。分析仪包括浊度仪、加样系统、试剂和样品转盘、清洗工作站等。四、速率散射比浊分析仪的基本结构与性能（二）性能特点用双光径系统设计，组合应用散射比浊法和透射比浊法两种技术，以及速率散射比浊法、速率抑制散射比浊法、近红外颗粒速率透射法、近红外颗粒速率抑制透射法四种方法，分别检测大、中、小分子。①LED光源（透射比浊）；②激光光源（散射比浊）；③聚焦镜头；④分光棱镜；⑤反应杯；⑥散射比浊检测仪；⑦激光反射；⑧透射比浊检测仪四、速率散射比浊分析仪的基本结构与性能（二）性能特点1.采用速率检测法实现，排除干扰信号，提高准确度。2.抗原过量自动监测

在抗体与抗原反应过程完成时，再加入已知相应抗原到反应体系中；如果新增的抗原可与过量的抗体结合反应，则产生新的速率峰，由此证明抗体过量，待测的抗原免疫反应完全；若新加入抗原后不出现新的速率峰，则说明反应体系中抗体不足，存在抗原过量，需将待测样品进一步稀释复测。3.全程动力学空白对照，排除非特异性的干扰，确保检测结果的可靠性。五、散射比浊分析仪的性能要求1.灵敏度

2.精密度

3.准确度

4.携带污染

5.温度准确度与波动度

6.样品和试剂加样准确度与重复性

第三节酶免疫分析仪器与技术一、酶联免疫吸附试验（一）酶联免疫吸附试验的原理酶标记固相免疫分析技术。抗体、抗原进行免疫反应后，标记的酶水解反应底物而使之显色。显色程度与其浓度成一定关系，能对抗原（或抗体）进行定性或定量。一、酶联免疫吸附试验（二）酶联免疫吸附试验技术常用酶与底物常用酶作用底物显色辣根过氧化物酶，HRP邻苯二胺，OPD四甲基联苯胺TMB黄色蓝色碱性磷酸酶

，ALP对-硝基苯磷酸酯PNP黄色β-半乳糖苷酶

，

β-Gal4-甲伞酮基-β-D-半乳糖苷葡萄糖氧化酶，GOD对硝基氮蓝四唑蓝色二、酶标仪（一）酶标仪的基本原理与结构基本工作原理和主要结构与光电比色计基本相同。相当于专用于ELISA的光电比色计或分光光度计。二、酶标仪（二）酶标仪的性能要求酶标仪计量性能评价要求包括：外观检查、示值稳定性、波长示值误差、波长重复性、吸光度示值误差、吸光度重复性、灵敏度、通道差异、绝缘电阻9项。与检测性能相关的有7项。示值稳定性要求在±0.005；波长示值误差±3nm；波长重复性±1.5nm；吸光度示值误差±0.03；吸光度重复性1%；灵敏度≥0.01L/mg；通道差异0.03。三、全自动酶免疫分析系统（一）全自动酶免疫分析系统的基本结构全自动酶免疫分析系统是具有自动加样本、加试剂，自动控温温育，自动洗板和自动判读计算等功能的分析系统。可用于各种酶免疫实验、血库筛查、生化检测、细胞培养、分子生物学等各个方面。三、全自动酶免疫分析系统（二）全自动酶免疫分析系统的特点1．加样系统加样系统用于样本和试剂的分配加样系统永久性加样针采用一次性吸头三、全自动酶免疫分析系统（二）全自动酶免疫分析系统的特点2．温控孵育系统提供在孵育时酶标板所需温度，防止蒸发，并可振荡孵育，可使免疫反应更加充分，提高检测灵敏度。3．洗涤工作站

洗涤工作站主要用于洗涤加样针和反应板。4．酶标仪洗板机酶标仪第四节化学发光免疫分析仪器与技术一、化学发光免疫分析技术原理与分类（一）化学发光免疫分析技术原理化学发光的原理在化学反应过程中，发光剂吸收化学能后，从稳定的基态分子被激发到不稳定的激发态，在激发态时分子有很高并且不稳定的能量，释放能量重新回到基态，能量以光子形式释放。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（一）化学发光免疫分析技术原理2.化学发光免疫分析的原理通过免疫反应特异性地将待测组分从样本中分离，再通过化学发光反应显示分离的组分，并且化学发光的反应强度与待测组分的含量成一定的比例关系。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类化学发光酶免疫测定将酶标记于示踪抗体上，再以酶催化底物进行化学发光反应。常用的工具酶有：辣根过氧化物酶（HRP）常用的底物有鲁米诺或其衍生物异鲁米诺，在HRP和启动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下进行发光反应，其波长为425nm。是一类重要的发光试剂。碱性磷酸酶（ALP），常用的底物是AMPPD，ALP水解AMPPD，产生金刚烷酮和产生470nm的光，可持续几十分钟。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类2.化学发光免疫测定用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，通过启动发光试剂（NaOH和H2O2）作用而发光，强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光。特点：化学反应简单、快速、无需催化剂；检测小分子抗原时一般采用竞争法，大分子抗原则大多采用夹心法。非特异性结合少、本底低；检测大分子灵敏度高。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类3.电化学发光免疫测定反应体系中含有三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+，再加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，电极加电压，使二价钌被氧化成三价，TPA被氧化形成强还原剂，形成激发态的钌，激发态的三联吡啶钌不稳定，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的钌，发光标记物可循环发光。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类4.光激化学发光免疫分析技术竞争法光激化学发光原理抗体包被感光微球，抗原包被发光微球，抗体与抗原结合，感光微球在680nm激发光照射下，产生单线态氧扩散至发光微球并传递能量，发光微球发射520～620nm荧光信号。单线态氧的半衰期只有4微秒（μs），在反应体系中只能扩散大约200nm。发光的量与样品中的待测抗原量成反比。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（三）顺磁性颗粒分离技术顺磁颗粒的核心为氧化铁，表面包有高分子化合物。特点：顺磁性：指有些固体的原子具有本征磁矩。当受外磁场作用时，表现出宏观磁性。没有外加磁场时，颗粒间没有相互作用，能够在液体中形成均匀的悬液。大比表面积：表面功能基团密度及选择性吸附能力变大，生物相容性：多数生物高分子如多聚糖、蛋白质等具有良好的生物相容性。功能基团特性：能与生物高分子的多种活性基团共价连接，可在其表面稳定地固定生物活性物质。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（一）化学发光免疫分析仪器的基本结构及其作用1.控制系统分析仪器的大脑，通常由软件系统和硬件系统组成。2.取样系统取样系统能够自动将样本和试剂定量加入反应管中。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（一）化学发光免疫分析仪器的基本结构及其作用3.反应孵育系统提供合适环境温度以便进行免疫反应。4.清洗系统用以去除化学发光反应所不需要的游离相。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（一）化学发光免疫分析仪器的基本结构及其作用5.测量系统化学发光反应产生的光信号通过光电倍增管进行测量，最后换算出相对发光单位（RLU）。6.试剂和消耗品系统保存试剂和消耗品，并维持合适的温度环境。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（二）化学发光分析仪器的性能要求反应区温度控制的准确性

应在设定值的±0.5℃内，波动度不超过±1.0℃。2.分析仪器的稳定性

分析仪开机处于稳定工作状态后第4小时、第8小时的测试结果与处于稳定工作状态初始时的测试结果的相对偏倚不超过±10％。3.批内测量重复性

CV≤8%。4.线性相关性

在不小于2个数量级的浓度范围内，线性相关系数（r）≥0.994。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（二）化学发光分析仪器的性能要求5.携带污染率

应≤10-5。6.分析仪应具备的主要功能

①用户可以通过人机对话指令，使仪器能自动完成不同样品、测试项目的分析任务；②仪器应能提示试剂等消耗品、废弃物的状态；③仪器具备自检功能；④仪器对操作错误、机械及电路故障应有相应提示。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（三）临床常用化学发光分析仪器的主要特点1．ACCESS2全自动免疫分析系统碱性磷酸酶标记，AMPPD作为发光底物，是典型的化学发光酶免疫反应。采用超细磁性微粒子技术，微粒子直径＜7μm；采用超声波清洗分离技术，清洗效率高，交叉污染率；直接穿刺式试剂盒，防止试剂挥发而浓缩。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（三）临床常用化学发光分析仪器的主要特点2．ARCHITECTi2000SR全自动免疫分析系统采用的是吖啶酯衍生物直接标记的化学发光免疫分析技术。采用的啶酯类衍生物增加了亲水基团，改善了吖啶酯化合物的水溶性，保证实验结果的可靠。RSH轨道处理系统采用人工智能机械臂样本传输轨道系统，提高了实验效率。二、化学发光免疫分析仪器的基本结构与性能要求（三）临床常用化学发光分析仪器的主要特点3．cobase系列电化学发光免疫分析系统采用电化学发光免疫分析原理，具有较高的灵敏度、较宽的检测范围和较快的检测速度。使用一次性加样头，避免交叉污染。采用模块化组合结构，可与生化分析仪器模块，组成生化免疫一体化仪器。第五节自动化免疫分析仪的临床应用自动化免疫分析仪的临床应用一、免疫荧光染色技术的应用常用于自身抗体检测，用于辅助诊断自身免疫性疾病。此技术还可用于免疫病理检测。也可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等膜分子的检测。二、时间分辨免疫荧光分析仪的应用适用于大、中、小分子的检测，可用于蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、抗原/抗体等。三、散射免疫比浊分析仪的应用散射免疫比浊分析仪目前在临床上主要用于蛋白质测定。自动化免疫分析仪的临床应用四、酶免疫分析仪器的应用全自动的酶免疫分析系统作为实验室常