分子生物学实验课考试答案

分子生物学实验课考核考试题库1、PCR原理是什么？2、PCR一般体系应加入哪些试剂？3、PCR防止其它DNA污染，应注意哪些问题？4、影响PCR产物产量的因素主要有哪些？5、引物设计应注意哪些问题？6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？7、什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？8、质粒抽提实验中溶液I、II、III各有什么作用？9、碱裂解法抽提质粒DNA的基本原理是什么？10、在碱裂解法提取质粒DNA操作中应注意哪些问题？11、在碱裂解法提取质粒DNA时，酚/氯仿的作用是什么？12、碱裂解法提取的质粒DNA分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异？13、提取植物基因组DNA的基本原理是什么？在操作过程中应该注意什么？14、在植物基因组提取过程中，DNA降解的可能原因？15、在植物基因组提取过程中，提高DNA产量的措施？16、在使用苯酚进行DNA提取时应该注意什么？17、在提取植物基因组DNA过程中，使用苯酚与氯仿的作用是什么？18、在植物基因组提取过程中，该如何检测和保证基因组DNA的质量？19、什么是限制性内切酶？20、常见的Ⅱ型限制性内切酶切割双链DNA后会产生末端或末端。21、下列有关限制性内切酶的描述，错误的是：（）A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性内切酶的活性受温度的影响C．限制性内切酶能识别和切割RNAD．限制性内切酶可以从原核中提取22、现有一长度为l000bp的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI酶切后得到的DNA分子仍是l000bp，用KpnI单独酶切得到400bp和600bp2种长度的DNA分子．用EcoRI，Kpnl同时酶切后得到200bp和600bp2种长度的DNA分子。请画出该DNA可能的酶切图谱。23、一个限制性内切酶的识别序列和切割位点是5ˊ一G↓GATCC一3ˊ，在质粒上有该酶的一个切点，请画出质粒被该限制性内切酶切割后所形成的黏性末端。24、基因工程中，切割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是()A．可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同B．必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同C．必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同D．可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端25、在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（）A.目的基因的提取和导入B.目的基因的导入和检测C.目的基因与运载体结合和导入D.目的基因的提取和与运载体结合26、在分子生物学实验中，常使用微量移液器，请说明在使用微量移液器时需要注意什么？27、现有量程为0.1-2.5μl；1-10μl；2.5-20μl；10-200μl；100-1000μl的移液器各一支，请问，当吸取0.15μl，0.5μl，5μl，15μl，100μl，750μl液体时，各需要选取那种最佳量程范围的移液器？28、本学期我们学习了CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和热休克法转化质粒DNA，你还知道哪些方法可以制备大肠杆菌感受态细胞和转化的方法？29、在质粒DNA转化大肠杆菌时，是如何进行筛选的？30、蓝白班筛选的原理是什么？31、在质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞时，如果将用来浸泡玻璃棒的酒精引燃起火该如何处理？32、卫星菌落出现的原因是什么？该如何避免？33、影响所制备感受态效率的因素有哪些？34、转化后为什么要温育1小时，为什么加入的是无抗培养基？35、如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？36、在转化实验中，实验组和对照平皿应有什么样的结果？如何解释这个结果？37、在学习制备感受态细胞时，为什么要保证细胞密度<108/ml？甘油的作用是什么？38、通过分子生物学实验，你认为自己掌握了哪些实验技能？你对分子生物学实验有哪些建议与意见？39、用琼脂糖凝胶分离DNA的理论依据是什么？40、为何在对凝胶进行操作时要带一次性手套？41、DNA分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷？它在电场中的移动方向如何？电泳中你观察到哪些现象？42、影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素有哪些？分别有何种影响？43、若有60kb～100kb大小的系列DNA片段要进行分离鉴定，应采取哪种类型的电泳方法才能进行有效分离？为什么？44、在质粒提起实验中，用溶液III处理后，要进行离心分离。此时，质粒DNA分子在（上清液，沉淀物）中，细菌基因组DNA分子在（上清液，沉淀物）中。45、在质粒提起实验的最后两步，要加入2倍体积的乙醇和70%的乙醇溶液。这里不同浓度乙醇的作用是什么？分子实验考核答案参考1、PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。双链DNA是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按5'→3'方向复制互补DNA，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种热变性→复性→延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物DNA可作为后一个循环的模板DNA参与DNA合成，使产物DNA的量按2^n方式扩增。

2、10*PCR缓冲液（含Mg+）、模板DNA、四种dNTP、一对引物、耐热Taq聚合酶3：标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污染；移液器使用要规范避免污标本间污染;无菌工作台操作，避免气体中有杂菌。

4：引物、酶的种类及浓度、dNTP的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、Mg2+浓度、温度与时间、循环次数5．引物设计应注意的问题：1.引物长度不宜过长20bp左右较佳；2.引物扩增片段的长度以200-500为宜；3.引物碱基的中G+C的含量应在40-60%为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带；4.避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是3'端的互补否则会形成二聚体结构；5.引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6.克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技术对基因进行大量扩增，首先准备好实验材料大体为：需扩增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR缓冲液、引物等、其过程大体分为3个步骤：第一步：变形：通过加热使DNA模板双螺旋链解离为单链，第二步：退火：当温度突然降低时。由于模板DNA结构复杂难再互补，而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA互补杂交从而使引物结合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下DNA连开始延伸。以上3个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量扩增的目的片段。7，a质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。b具有复制起点。携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切酶的切割位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。

8，溶液I:由葡萄糖,EDTA,TrisCl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA;EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用;TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。溶液II:由SDS与NaOH组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH>12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性。

溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液.能中和溶液II的碱性,使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。9.碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。PH介于12.0~12.5时，线性DNA变性，双链打开，而质粒DNA虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当PH恢复到中性时，质粒DNA可迅速准确的完成复性，而线性DNA复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。

10.（1）正确使用移液器。（2）溶液ll必须新鲜配制。（3）加入酚-氯仿后必须充分混匀。（4）混匀的过程不能太过剧烈。（5）每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。（6）吸取酚-氯仿溶液时要将Tip头插入液体分层的下侧。【可根据第一次试验自己写的注意事项进行补充】11.酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质12.超螺旋DNA＞线性DNA＞开环DNA13.①基本原理:利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经异丙醇沉淀。②注意事项:⑴材料要新鲜娇嫩，叶片研磨地越细越好；⑵操作应为无菌操作；⑶操作应温和，不宜剧烈晃动；⑷注意移液器的正确使用。14.原因:⑴从植物中提取DNA时没对细胞内的DNA酶进行灭活；⑵操作过程中被细菌污染了；⑶口水等含酶物质飞入样品中；⑷温度、PH等变化过于剧烈。15.应当选取幼嫩的叶片，因为幼嫩叶片中的DNA含量高些；组织抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破坏；纯化时注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整个实验过程应该温和操作，不能剧烈振荡，混合过程要轻缓，减少抽提，减少DNA片段被认为降解，因为过度振荡会使DNA断裂成小片段。16.酚一定要进行碱平衡，苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人体造成损伤，应当注意防护；它是出去蛋白质的，要充分振荡使蛋白质变性，但不能太剧烈而打断DNA；离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚—氯仿，尽量只取上清，不应该让苯酚最后仍有残留，需抽提干净。17.用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保证提取的基因组较纯净。18.检测：琼脂糖凝胶电泳；保证DNA活性:用EDTA抑制DNA酶活性，从而保证DNA不被破坏。19限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，有三种类型，Ⅰ类，Ⅱ类，Ⅲ类，他们都有甲基化修饰功能和限制酶功能，Ⅱ类常用于分子克隆20.粘性，平21.C22.实验课见黑板上23,--GGATCC--写在上面，下面为--CCTAGG--该酶为限制性内切酶I24，A25：D26：1.确定合适的量程，不可超过量程取液。2.取液时按到第一档，Tip头垂直进入液面3-5毫米取液。移液器注意不能接触溶液。3.打出液体时贴壁并有一定角度，要按到第二档将液体全部压出。4.使用完毕后，打下tip头，放好移液器。27.分别是0.1-2.5，0.1-2.5，1-10，2.5-20，10-200，100-1000。

28，氯化铷法，甘油—聚乙二醇法，一步法29题.因为质粒pETBlue-2带有青霉素抗性基因,所以转化成功的大肠杆菌细胞能在含羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长形成菌落.所以用含羧苄青霉素的琼脂糖平板可以筛选出转化成功的大肠杆菌.30.见实验指导92面的实验原理的后半部分!

31.用水打湿的毛巾，着火时用毛巾盖上就行了32.（1）卫星菌落是氨苄降解后生长的杂菌。可能是感受态细胞的问题也可能是转化过程出现操作失误例如未在冰中进行转化，感受态在常温下放置过久失活，转化后摇菌时间过短，或者摇床速度过慢，没有把菌摇起来，如果不是转化过程出现的问题就要进一步考虑连接是否正确，连接时间12~16h，体系一般6ul-10ul，目的片段：载体一般1:3~1:10.（2）可以将培养时间控制在12h-16h之间，或者更换抗生素为羧苄青霉素33：影响因素有（1）大肠杆菌生长状态（2）氯化钙浓度（3）冰上放置时间（4）保存温度

34题、第一问：温育就是让感受态恢复一下状态，以及一些相关抗性基因的表达。毕竟从-70℃环境中取出，需一段时间适应才可转化。

第二问：因为细胞比较脆弱，加无抗培养基是为了让细胞生长，促使在转化过程中获得的新表型得到表达。35.（1）操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂DNA的污染（2）细菌在感受态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落（3）所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长（4）一些实验误差，错将菌液放错36.实验组中长出菌落而对照组中无任何菌落生长37.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，密度过高或不足均会影响转化效率，一次要保证细胞密度<10^8/ml。甘油的目的是为了防止水在冻结过程中产生过大的冰晶损伤细胞，抑制大肠杆菌生长，以便保存。

38.（主观题，言之有理即可，例：凝胶电泳，PCR扩增等）39.DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速率向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。40.琼脂糖凝胶电泳时戴一次性手套能够有效阻止EB的渗入．

EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套

41、DNA带负电荷，在电场中向正极移动42.①电压越大速率越大。②DNA分子量越小速率越大。③DNA的分子结构：超螺旋最快，线型次之，开环最慢。④介质的种类和浓度。⑤EB⑥电泳缓冲液43，恒定电场强度下的琼脂糖凝电泳。糖凝胶可以制成不同大小的孔隙度，具有分子筛的效应，所以恒定场的琼脂糖凝胶电泳适于分离60kb_100kb的DNA片段，DNA片段的迁移率和分子的大小和高级结构有密切关系。44、上清液沉淀物45.无水乙醇的为了是沉淀DNA继而达到浓缩DNA的目的，70％的乙醇是为了洗涤DNA,进一步除去杂质。建议课时：1-2课时一、实验目的（1）掌握跨境电商物流渠道分析的流程和方法（2）实操进行跨境电商物流渠道分析二、实验知识准备（一）国际物流概述国际（地区间）物流是跨境电商发展的必备环节，其发展水平高低也成为跨境电商供应链融合及跨境电商供应链企业获得经营效益的关键因素。跨境电商与国际物流相互影响而又紧密联系的，跨境电商为国际物流的发展提供市场机会空间，而国际物流的流畅运转则是保障跨境电商发展的必要条件。根据速卖通物流团队对未来十年的预测，全球贸易形态会有60%由集装箱转为包裹，全球买家不会再介意货物在世界哪个角落，包裹会在72小时内全球送达。（二）国际物流模式分类跨境电商B2C国际物流模式主要分为以下3种。1、国际快递国际（地区间）快递主要是通过国际（地区间）商业快递公司来解决跨境电商之中商品配送及物流的问题。在国际（地区间）上知名的国际（地区间）快递公司包括UPS、TNT、FedEx、DHL等，其服务时效可通达全世界大部分国家（地区），但是其价格也相对昂贵；中国邮政速递也提供国际（地区间）商业快递的服务，其价格优于国际（地区间）知名的四大快递公司，但其时效会稍差一些。2、国际（地区间）邮政小包国际（地区间）邮政小包是服务于跨境电商的一种物流模式，主要通过万国邮政联盟来解决商品配送及物流问题，以个人邮包的形式进行发货；而万国邮政联盟是世界邮政国际组织，它是加入其中的成员国处理邮政事务的国际（地区间）组织，目前其成员国在200个左右。国际（地区间）邮政小包具有成本低、通关容易等优势，但在实际运营过程中，国际（地区间）邮政小包的丢包率高、安全性低、时效性不强等劣势较为突出；同时使用国际（地区间）邮政小包进行物流运输，还受制于包裹形状、体积、重量等因素，在一定程度上影响物流效率及物流体验。以下以中国邮政小包和e邮宝为例讲解。（2）中国邮政国际（地区间）小包1）中国邮政小包中国邮政小包是中国邮政开展的一项国际（地区间）邮政小包业务服务，属于中国邮政航空小包的范畴，是一项经济实惠的国际快件服务项目。邮政国际（地区间）小包主要指是重量在2千克以下，外包装长宽高之和小于90厘米，且最长边小于60厘米，通过邮政邮寄到全球各地的一种快递。2）国际小包国际小包主要分为两种：普通平邮和挂号。普通平邮费用低，没有挂号费，不能进行跟踪查询服务。挂号可以提供查询跟踪服务，价格比普通平邮高一点。3）邮政国际小包的优势介绍：价格优势：资费较低，分服务区计费，每个区域按千克价计费。全球化：中国邮政航空小包可以将产品送达全球几乎任何一个国家（地区）的客户手中，只要有邮局的地方都可以到达，扩展了外贸卖家的市场空间。适用范围广：速卖通、eBay、敦煌等平台都可以使用，一般无特别的邮寄限制，除了国际（地区间）违禁品和危险品以外。（3）国际e邮宝：1）国际e邮宝概述中国邮政为适应国际（地区间）电子商务寄递市场的需要，为中国电商卖家量身定制的一款全新经济型国际（地区间）邮递产品。国际e邮宝和香港国际小包服务一样是针对轻小件物品的空邮产品，目前，该业务限于为中国电商卖家寄件人提供发向美国，加拿大，英国，法国和澳大利亚的包裹寄递服务。2）国际e邮宝优势介绍经济实惠，支持按总重计费，50克首重，续重按照每克计算，免收挂号费。时效快，7-10天即可妥投，帮助卖家提高物流得分。专业，为中国eBay卖家量身定制。服务优良，提供包裹跟踪号，系统与eBay完美对接，一站式操作。3、国际（地区间）物流专线国际（地区间）物流专线其特征主要体现在“专”上，因而国际（地区间）物流专线有其专门使用的物流运输工具、物流线路、物流起点与终点、物流运输工具、物流运输周期及时间等，同时它还是根据特定国家或地区跨境电商物流特点所推出的物流专线；比如现在已开通的中欧班列、俄罗斯专线等。国际（地区间）物流专线相对与国际（地区间）邮政小包来说，物流时效更好，但价格比邮政小包更贵一些，其覆盖面弱于较邮政小包；相对国际（地区间）商业快递，其价格更低，但时效上不如商业快递。以上三种物流渠道都可以将包裹寄送到买家手中，其各自有自己的优势和缺点，在跨境电商实际运营过程中，商家可以根据自己的店铺定位、产品、订单金额利润等因素来选择合适的物流方式。（三）跨境电商通关跨境电商推动了国际贸易的自由化、便利化和业态创新，对中国企业从产品出海到品牌出海，增强综合竞争力具有重要的意义。但同时也对以传统外贸为背景制定的交易、支付、物流、通关、退税、结汇等相关政策提出了新的挑战。至今，国务院已先后同意在全国设立了105个跨境电子商务综合试验区，在跨境电商技术标准、业务流程、监管模式和信息化建设等方面先行先试。在此背景下，2014年2月10日，海关总署增列了监管方式代码“9610”，独创“清单核放、汇总申报”通关方式，专门为跨境电商服务，以提升跨境电商企业通关效率。跨境电商监管方式“9610”，适用于境内个人或电子商务企业通过电子商务交易平台实现交易，并采用“清单核放、汇总申报”模式办理通关手续的电子商务零售进出口商品（通过海关特殊监管区域或保税监管场所一线的电子商务零售进出口商品除外）。“清单核放”即跨境电商企业收到订单后，通过跨境电商外贸综合服务平台将订单、支付单、运单等相关信息报送至海关系统，由海关进行核放出区。这极大得解决了跨境电商B2C出口订单批次多、数量少的问题。“清单核放”顺利解决了报关时间长、容易出错等问题，从而让企业通关效率更高、降低通关成本。“汇总申报”是跨境电商企汇总上月结关的清单生成汇总申请单，进入国际贸易单一窗口进行报关，解决了很多繁琐的线下环节。实验内容1.物流渠道订单数量分析（1）业务背景基于跨境电商数据化运营与决策系统进行物流渠道分析，分析各物流渠道占比、各物流渠道对应的top国家、top类目数据，有助于商家更好地制订物流方案。（2）实训操作进入跨境电商数据化运营与决策系统，依次单击“物流分析”“物流渠道分析”，进入物流渠道分析界面。选择查询时间，如2020年7月，在查询结果中，首先可看到各物流渠道的订单量占比数据，我们可选择视图或表格模式。在视图模式下，观察各物流渠