人类IDH1基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）（CSZ2100196）

3 3 3 3 4 4 5 9 13一、申请人名称厦门艾德生物医药科技股份有限公司厦门市海沧区鼎山路39号厦门市海沧区鼎山路39号一、产品概述（一）产品主要组成成分本试剂盒含有IDHPCR反应条、IDH混合酶、IDH阳性对照，详见表1、表2。表1试剂盒组成表2IDHPCR反应条的组成1238/备注：不同批次试剂不可混用。（二）产品预期用途本试剂盒用于体外定性检测急性髓系白血病（AML）患者骨髓样本DNA中人类异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变基因，检测的突变位点为：394C>A、395G>A、394C>T、395G>T和394C>G，用于艾伏尼布片（Tibsovo片）的伴随诊断。检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。（三）产品包装规格（四）产品检验原理本试剂盒基于扩增阻碍突变系统和荧光PCR技术实现骨髓样本DNA中IDH1基因突变的检测。本试剂盒针对IDH1基因突变位点设计特异的突变检测引物，PCR扩增时，由于该引物3'末端的碱基与突变型模板完全配对，引物延伸并扩增出突变模板；而与野生型模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，野生型模板扩增被抑制，从而实现IDH1基因突变的检测。本试剂盒基于荧光PCR技术，通过FAM标记的荧光探针，在1~3号管实现IDH1基因突变的实时检测，在8号外控管实现IDH2基因外显子3区段的检测，用于监控样本质量；另外，反应体系中还包含检测人类IDH1基因保守区域（IDH1基因外显子6区段）的引物和HEX标记的荧光探针，作为内控试剂用于结果判读及监控样本的质量。本试剂盒PCR扩增反应系统同时含有UNG酶，可以选择性断裂含有dU的PCR片段中的尿嘧啶糖苷键，有效降低因PCR产物污染产生的假二、临床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的选择本产品的主要原材料包括引物、探针、DNA聚合酶、UNG酶和dNTP，这些原材料均为外购方式获得。自行设计的引物和探针委托专业的合成公司合成，并经HPLC纯化获得；DNA聚合酶、UNG酶和dNTPs等均由有资质的原料供应商提供。通过功能性试验，申请人筛选出最佳原材料和供应商，同时制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。2.企业参考品和对照品的设置情况申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品，参考品均采用临床样本制备而成。阳性参考品共13支，包括不同突变比例下试剂盒可检出的所有突变类型。阴性参考品共9支，7支为野生型人基因组DNA，另外含1例非人基因组样本和1例试剂盒检测范围外的IDH1基因突变阳性细胞系样本。检测限参考品共5支，包括试剂盒可检出的所有突变类型。精密度参考品共5支，包括阴性精密度参考品、不同突变比例所有突变类型的阳性精密度参考品。产品设置了阳性对照（PC）和阴性对照（NTC，自备纯化水），用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。（二）生产工艺及反应体系研究申请人对该产品反应体系的研究包括适用样本类型的研究、各组分和酶液等使用量的研究、靶基因和内外控引物及探针浓度的研究、PCR扩增反应条件的研究和循环数研究等。通过功能性实验，确定了最佳的反应体系。申请人根据试剂盒中试剂和组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。（三）分析性能评估本产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、最低检测限、分析特异性、核酸提取性能等研究。申请人提交了三批产品在适用机型上的性能评估资料。准确度研究中，使用3批成品试剂盒在适用机型上对阳性参考品和阴性参考品进行检测，检测结果显示阳性参考品符合率、阴性参考品符合率均为100%。精密度研究中使用3批成品试剂盒在适用机型上对阴性临床样本、弱阳性和中阳性临床样本进行检测，评价本产品批内、批间及检测日内、日间、操作者间精密度，结果显示检测结果符合率均为100%，检测变异系数均不大于5%。最低检测限研究中，申请人使用不同核酸浓度和不同突变比例的样本进行检测，采用95%（n=20）的阳性检出率作为标准，初步确定产品最低检测限。然后使用3批成品试剂盒在适用机型上对检测限参考品进行验证，本试剂盒在10ng基因组DNA背景下，能够检出1%的基因突变。分析特异性研究包含交叉反应研究和干扰研究，交叉反应研究包括序列相近、具有一定同源性的其他常见突变类型及AML其他常见基因突变类型（包括试剂盒涵盖范围外的IDH1基因1种突变类型，IDH2基因11种突变类型，FLT3、NRAS、NPM1和JAK2基因各1种突变类型）、野生型基因序列和非人类基因组基因。申请人使用3批试剂盒对交叉反应样本进行检测，结果显示均无交叉反应。干扰试柠檬酸钠（0.645mol/L）、EDTA（27μmol/L、内源性干扰物质（血红蛋白（3g/L）、甘油三酯（37mmol/L）、白蛋白（60g/L）、胆红素（342μmol/L））和药物阿糖胞苷（60μg/mL）对检测结果无影响，肝素钠（终浓度150U/mL）对检测结果有一定抑制作用。申请人采用临床样本进行了核酸提取试剂盒性能的研究，根据与该产品的组合性能研究结果，确定推荐的核酸提取试剂符合检测需求。（四）阳性判断值研究阳性判断值的建立研究选取了210例AML骨髓样本，分别统计FAM通道Ct值和ΔCt值，通过受试者工作特征（ROC）曲线确定本产品的阳性判断值，再用另外一批51例临床样本上对阳性判断值进行验证。另外对1121例临床试验样本的检测结果进行统计分析，进一步对阳性判断值进行验证。最终确定阳性判断值见表4。表4结果判定123ΔCtCut-off值899当样品突变Ct值大于或等于阴性临界Ct值时（即落于阴性区则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。当样品突变Ct值小于阴性临界值时，进行如下判断：当某个反应管的突变Ct值小于阳性临界值时（即落于阳性A区），则该样品为该反应管对应的突变阳性，即阳性A区；当反应管的突变Ct值大于阳性临界值时，且小于阴性临界Ct值时（即落于阳性B区则计算该反应管的ΔCt值（突变Ct值-外控Ct值），若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCtCut-off值，则该样品也为该反应管对应的突变阳性，即阳性B区；反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。（五）稳定性研究申请人对本产品实时稳定性、运输稳定性、开瓶冻融稳定性和样本稳定性进行了系统的研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。实时稳定性研究：将3批试剂盒储存于规定储存条件下，分别在0、6、8和10个月对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察，各项性能指标均符合要求，确定产品在20±5℃条件下，可此外，申请人对产品的开瓶冻融稳定性、运输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品性能均能满足产品说明书声称。三、临床评价概述申请人提交了试验体外诊断试剂的临床检测性能和伴随诊断意义的临床试验资料，分为如下两部分。（一）临床检测性能本产品在福建医科大学附属协和医院、浙江大学医学院附属第一医院和苏州大学附属第一医院3家临床试验机构进行临床试验，采用试验体外诊断试剂与sanger测序进行比较研究，确认本产品的临床检测性能。入组病例为急性髓性白血病（AML）患者，样本类型为骨髓样本，共纳入1121个病例，其中阳性样本140例，阴性样本981例。试验结果显示：试验体外诊断试剂与sanger测序的阳性符合率为100%（95%CI：97.2%，100.00%），阴性符合率为99.1%（95%CI：98.3%，99.5%），总符合率为99.2%（95%CI：98.5%，99.6%）。（二）伴随诊断意义试验体外诊断试剂的伴随诊断证据采用桥接试验的路径提交，桥（AG120-C-001和CS3010-101）入组人群的样本。1.与药物临床试验入组人群筛选试剂CTA检测结果的一致性该部分研究的样本共纳入158例样本，试验体外诊断试剂与CTA2.试验体外诊断试剂的桥接药物疗效针对药物关键性临床试验纳入的204例IDH1基因突变阳性的骨髓样本，本次桥接试验纳入118例，试验体外诊断试剂检测阳性的110例。针对药物关键性临床试验中的主要评价指标，上述110个病例的CR+CRh率为31.8%（95%CI：23.3%～41.4%与药物关键性临床试验结果基本一致；对于药物关键性临床试验中的其他次要评价指标也进行了充分评价，结果显示，上述110个病例的次要评价指标结果也与药物关键性临床试验中的结果基本一致；同时，针对需要进行敏感性分析的情况也进行了充分分析。综上所述，该产品临床试验设计符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的相关要求，临床试验结果显示该产品临床性能满足临床要四、产品受益风险判定根据YY/T0316-2016《医疗器械－风险管理对医疗器械的应用》对产品进行风险分析。本产品用于艾伏尼布片的伴随诊断，为临床医生对急性髓系白血病（AML）患者选择靶向药物提供依据。检测结果仅供临床参考，具体临床应用时，临床医生必须结合病例实际情况进行综合判断。本产品临床应用的主要受益在于：作为艾伏尼布片的伴随诊断试剂对靶向用药人群进行筛选，便于IDH1突变检测阳性的AML患者获得及时的治疗。（二）风险评估申请人对已知危险（源）进行风险评价，按照风险可接受准则判断每个危险（源）的风险是否达到可接受水平，对合理可行降低的风险、不经过风险/收益分析既判定为不可接受的风险采取控制措施，并对具体措施进行实施验证，同时重新对采取措施后的风险进行估计，确认其风险水平是否可接受。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提示以下信息：1.本试剂盒用于体外定性检测急性髓系白血病（AML）患者骨髓样本DNA中人类异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变基因，检测的突变位点为：394C>A、395G>A、394C>T、395G>T和394C>G，用于艾伏尼布片（Tibsovo片）的伴随诊断。检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。2.警示及注意事项：产品说明中介绍了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第739号）、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督建议准予注册。附件：产品说明书通用名称：人类IDH1基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。主要是将细胞质中的异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG参与三羧酸循环氧化供能，是多种代谢途径所需的非线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的主要来源[1]。近IDH1抑制剂药物治疗中获益[7-8]。因此对IDH1基因突变的检测可以指导患者治本试剂盒针对IDH1基因突变位点设计特异的突变检测引物，PCR扩增另外，反应体系中还包含检测人类IDH1基因保守区域（IDH1基因外显子61238/1.厦门艾德生物医药科技股份有限公司的核酸提取试剂（型号：新鲜血液/3.骨髓样本运输条件：2~8℃恒温运输或者泡沫箱加冰袋密封运输，运输时5.DNA提取完毕后，建议立即进行检测，检测前请对核酸进行准确定量，在每次PCR反应中，每份样品必须和阳性对照（PC）、阴性对照（NTC，ABCDEF1NTC2NTC3NTC4//////5//////6//////7//////8NTC9.实验结束后，使用2层PE手套包扎好PCR反应条，并按生物垃圾处理。2.突变结果的确定：首先确定样品各个反应管各自的突品的外控反应管Ct值。由于样品中突变百分含量各不相同，所得到b）当样品突变Ct值小于阴性临界值时，进行下列判断：i.当某个反应管的突变Ct值小于阳性临界值时（即落于阳性A区），则该个或2个以上反应管出现阳性结果（按照表4判读）时，先确定突变反应管中ii.若△Ct值大于或等于交叉阈值，则认为是交叉信号，可判为该突变反应8联管编号123阳性A区突变Ct值Ct<24Ct<26Ct<26阳性B区突变Ct值24≤Ct<2626≤Ct<2826≤Ct<28ΔCtCut-off值899突变Ct值Ct≥26Ct≥28Ct≥28----“*”根据人工合成质粒的实验数据获得。1.阴性对照(NTC)的1～3号管的FAM信号应无明显扩增曲线。若1～信号及8号管的FAM信号偶尔升起，而1～3号管的FAM信号无扩增曲线，不3.样本8号反应管（外控反应管）的FAM信号应有明显扩增曲线，且Ct值应在或DNA加入量过少，需要重新提取DNA或增加DNA上样量再进行试验；此4.待测样品1～3号管内控VIC信号应有明显的扩增曲线且Ct值小于31。若1～33.不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验环境均有可能进行检测，检测结果显示阳性参考品符合率、阴性参考品符2.精密度研究中使用3批成品试剂盒在适用机型上对阴性临床样本和弱阳性和中阳性临床样本进行检测，评价本试剂盒批内、批间及检测日内、日间、操作者间精密度，结果显示检测结果符合率均为100%，检测变异系3.最低检测限研究中，使用不同核酸浓度和不同突变比例的样本进行检测，采用95%（n=20）的阳性检出率作为标准，初步确定产品最低检测限。然后使具有一定同源性的其他常见突变类型及AML其他常见基因突变类型（包括试剂盒涵盖范围外的IDH1基因1种突变类型，IDH2基因11种突变类型，FLT3、扰试验结果显示，临床样本中可能存在的外源干扰物质（葡萄糖（1.2g/L）、柠檬酸钠（0.645mol/L）、EDTA（27μmol/L））、内源性干扰物质（血红蛋和药物阿糖胞苷（60μg/mL）对检测结果无影响，肝素钠（终浓度150U/mL）5.采用临床样本进行了核酸提取试剂盒性能的研究，根据与本试剂盒的组合性本产品在3家临床试验机构进行临床试验，采用试验体外诊断试剂与sanger测序进行比较研究，共纳入1121个病例，本产品与sanger测序的阳性符合率为尼布片的关键性药物临床试验入组人群的样本。针的桥接药物疗效，本产品检测阳性病例的主2.本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到DNA提取质量、荧光定量PCR仪型号、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制，可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、4.本试剂盒所有试剂均经过特别配制，以用于上述检测。随意替换试剂盒中的5.应该严格区分阳性对照和反应试剂的使用，防止污染试剂对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加DNA模板时，使用单独、专用的移