《微生物发酵技术》-项目八 分离技术

1.萃取分离技术项目八分离技术中药现代化超临界流体萃取在薏苡仁脂性抗瘤有效成分提取项目上试验成功。我国中药萃取技术获重大突破。展示出巨大的产业化前景。每年还可节约数以万吨计的石油资源。萃取分离技术定义：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同，而使溶质得到纯化或浓缩的方法。应用：有机酸、氨基酸、抗生素、维生素、激素和生物碱等生物小分子。分类：液液萃取、液固萃取、双水相萃取和超临界萃取等。基本概念被提取的溶液称为料液；从料液中提取出来的物质称为溶质；用来进行萃取的溶剂称为萃取剂；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液为萃取液；被萃取出溶质的料液称为萃余液。乳化一种液体分散到另一种本不相溶的液体中，称为乳化现象。乳化现象的产生将直接影响溶剂萃取操作的效果，影响收率和产品质量。1234离心分离稀释法升高温度吸附法5转型法破乳化常用的去乳化剂十二烷基磺酸钠。属于阴离子表面活性剂，为淡黄色透明液体，易溶于水，微溶于有机溶剂，广泛用于红霉素的取。漠代十五烷基毗噬。一种棕褐色稠厚液体，广泛用于青霉素等抗生素的提取中。萃取方式料液和萃取液充分混合形成乳浊液，目的产物自料液转入萃取液中。将乳浊液通过离心设备分成萃取液和萃余液。从萃取液或萃余液中回收萃取剂。（1）混合（3）溶剂回收（2）分离2.沉淀分离技术沉淀通过改变条件或加入某种试剂，引起物质的溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。它具有设备简单、成本低、浓缩倍数高、收率高等特点。常用方法有盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法，今天我们着重学习一下其中的盐析法。定义：盐析法又称中性盐沉淀法，在发酵液中加入高浓度中性盐能破坏蛋白质（或酶）的胶体性质，中和表面上的电荷，促使蛋白质（或酶）聚集成更大的分子团而沉淀。一般适用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液粗提取。定义：无机盐不容易引起蛋白质变性失活，盐析过程中非蛋白的杂质很少被夹带沉淀下来，适用范围广，几乎所有的蛋白质和酶都能采用，设备简单，操作方便。优点：沉淀物中含有大量盐析刑，需要进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。缺点：盐析法蛋白质（或酶）等生物大分子物质以一种亲水胶体形式存在于水溶液中，无外界影响时，呈稳定的分散状态。其主要原因是：蛋白质为两性物质，在一定的pH下表面显示一定的电性，由于静电排斥作用，使分子间表现为互相排斥而稳定；另外，蛋白质分子周围，水分子有序排列，在其表面上形成水化膜，水化膜层能保护蛋白质粒子，避免其因碰撞而聚集沉淀。原理：在溶液中加入一定量的中性盐，由于中性盐的亲水性比蛋白质（或酶）的亲水性大，盐离子在水中能与大量的水分子结合而发生水化，而使蛋白质脱去水化膜；同时由于中性盐的解离，中和了蛋白质（或酶）颗粒所带的电荷，颗粒间失去了相互的排斥力，在布朗运动下能够相互靠拢、聚集起来成为沉淀而析出。影响蛋白质盐析效果的主要因素1234盐析剂种类溶液的pH值盐析剂的加入量温度5操作方式以及蛋白质（酶）的种类和浓度6搅拌盐析剂的选择在蛋白质盐析中，一般阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价态阴离子更为明显。通常可以采用的盐析剂有硫酸镜、硫酸刷、硫酸镜和磷酸伺（铀〉等。但是在实际应用中，硫酸锻是最常用的一种盐析剂。主要是因为硫酸镀价格便宜、榕解度大，而且受温度影响小，具有稳定蛋白质的作用。但它在较高pH值溶液中容易释放氨，在贮存过程中常会变酸，对金属具有腐蚀性。盐析剂的加入量盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类和酶液中杂质的性质、数量有关，应以收率最高的用量为标准。具体用量需要通过对比实验和生产实践摸索才能确定。温度和pH值除了盐析剂的种类外，盐析操作的温度和pH值是获得理想盐析沉淀的重要因素。盐析时的温度选择要以不降低酶的活力为原则，既要考虑保持酶的稳定性，也要适当地考虑盐析效果。大多数蛋白质都在室温下进行盐析。盐析的pH值选择也要以不降低酶的活力为原则。由于蛋白质在等电点时最容易沉淀，因此可选择等电点附近的pH值作为盐析pH。但为了防止pH值对酶活力的影响，可通过试验选择在酶稳定的pH值范围内进行盐析。操作方式盐析时操作方式不同，会影响所需的盐量，也会影响沉淀物颗粒的大小，盐析操作条件要温和，不能引起蛋白质变性。3.膜分离技术膜分离技术以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离纯化的方法。这是人类最早应用的分离技术之一。如酿酒业中酒的过滤，从天然植物（中药）提取有效成分等。定义：膜分离技术目前生产的膜过滤装置都是由膜组件或膜装置构成。一个膜装置由膜、固定膜的支撑物、间隔物以及收纳这些部件的容器构成。目前市售商品膜组件主要有管式、平板式、螺旋卷式和中空纤维式等四种。如图8-7所示为螺旋管式超滤膜组件构造。1、膜过滤装置组件膜分离技术包括微滤（MF）、超滤（UF)、（反渗透RO）、透析（DS）等，各种膜分离法的原理和应用范围列于表8-1。2、膜分离法的应用膜分离技术在生物产品的分离和纯化方面，膜分离法的应用大致可分为下列四个方面，如图8-8所示。2、膜分离法的应用发酵液的过滤与细胞的收集是指同一操作仅从不同的角度考虑。如果所需要的目的物在液体中，则废弃菌体细胞，这时的过滤操作称为发酵液的过滤，如果所需要的产品在细胞内，或细胞本身就是目标产物，则称为细胞的收集。膜分离技术（1）发酵液的过滤与细胞收集氨基酸、抗生素、有机酸等发酵产品的相对分子质量都在2000以下，而通常超滤膜的（MWCO）截留分子量在10000-30000之间，因而能透过超滤膜，而蛋白质、多肽、多糖等杂质被截留。对上述产物的后续处理有利。膜分离技术（2）小分子生物产物的回收经过超滤或透析后，溶液浓度会变稀，为便于后道工序的处理，常需要浓缩，为避免对热敏性产品的影响，不采用传统的蒸发方法进行浓缩，可以采用反渗透法浓缩，操作时要注意膜的消毒，避免破坏目标产品。膜分离技术（3）浓缩热原是由细菌的细胞壁产生，主要成分为脂多糖类、脂蛋白等物质，相对分子量较大，注入体内会使体温升高，传统的去热原方法是活性炭吸附或石棉板过滤，但是前者会造成产率下降，后者对操作者身体有害并且对产品质量有一定的影响。当产品相对分子量在1000以下，用截留分子量为10000的超虑膜可以有效地除去热原，并且不影响产品的回收率。膜分离技术（4）除热原膜分离技术膜污染：膜分离过程中遇到的最大问题是膜污染，即膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象，称为污染。污染的原因一般认为是膜与料液中某一溶质的相互作用，或吸附在膜上的溶质和其他溶质相互作用而引起的。膜污染是不可逆的。膜污染不仅造成透过通量的大幅下降，而且造成目标产物的回收率下降。为保证膜分离操作高效稳定的进行，必须对膜进行定期清洗，除去膜表面及膜孔内的污染物，经清洗后，如纯水通量达到或接近原来水平，则可以认为污染已经消除，膜的透过性能已经恢复。3、膜的污染与清洗膜分离技术膜清洗：选用清洗剂的要求为：清洗剂要具有良好的去污能力，同时又不能损害膜的过滤性能。膜的清洗一般选用水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、氧化剂和酶溶液等为清洗剂。具体采用何种清洗剂要根据膜的性质和污染物的性质而定。3、膜的污染与清洗4.发酵产物精制工艺流程结晶技术结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。结晶是一种比较古老的物质分离纯化方法，现在仍然普遍使用。由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶过程具有高度选择性，析出的晶体纯度很高，物质能否结晶主要取决于其自身的性质，此外还必须在一定的条件下才能形成晶体。结晶技术1234样品的纯度pH值溶液的浓度温度5晶种1、结晶形成的条件结晶技术①样品的纯度：一般要求结晶液的纯度达到50%以上才能形成晶体，结晶容易形成。②溶液的浓度：一般要求结晶液的浓度较高，以利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，当浓度过高时，相应杂质的浓度及溶液黏度也增大，反而不利于结晶析出，或生成纯度较差的粉末结晶。因此应根据工艺和具体情况确定或调整溶液的浓度，才能得到较好的结晶。1、结晶形成的条件结晶技术③pH值：有时只差0.2个pH单位就只得到沉淀而不能形成微晶或单晶。调整pH值可使晶体长大到最适大小，也可改变晶形。结晶溶液pH值一般选择在被结晶酶的等电点附近。④温度：结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下，不仅溶解度低，而且不易变性，又可避免细菌繁殖。⑤晶种：不易结晶的活性物质，需加入微量的晶种才能结晶。例如，在胰凝乳蛋白酶结晶母液中加入微量胰凝乳蛋白酶结晶可导致大量结晶的形成。结晶技术重结晶，特别是在不同溶剂中反复结晶，能使纯度提高。因为杂质和结晶物质在不同溶剂中和不同温度下的溶解度是不同的。重结晶的关键是选择合适的溶剂。通过重结晶，可使粗制品或不合格品中的杂质除去，产品的色级及纯度等获得提高，是进一步提纯精制生物产品的有效方法。2、重结晶干燥技术工业上要获得固体产品如抗生素、酶制剂、味精、柠檬酸和酵母等，都需要进行干燥处理，以除去物料中的水分，使产品方便保存、运输和销售及使用。按照热源和供热方式的不同，比较常用的干燥方法有常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥和红外线干燥等。干燥设备的种类繁多，主要有：厢式干燥器、真空干燥器、冷冻干燥器、管式气流干燥器、沸腾干燥器以及喷雾干燥器等。浓缩技术把