蛋白质相互作用

蛋白质相互作用研究方法后基因组时代(post-genomicera)在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能，而且有些蛋白质的功能只有在复合体形成后才能发挥出来，如依赖于构象变化或翻译后修饰的蛋白质功能蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。StelzlU,etal.Cell,2005,122(6):957~968GavinAC,etal.Nature,2002,415(6868):141~147RainJC,etal.Theprotein-proteininteractionmapofHelicobacterpylori.Nature,2001,409(6817):211~215GiotL,etal.AproteininteractionmapofDrosophilamelanogaster.Science,2003,302(5651):1727~1736LiSM,etal.AmapoftheinteractomenetworkofthemetazoanC.elegans.Science,2004,303(5657):540~543内容蛋白质与蛋白质之间相互作用蛋白质与核酸之间相互作用蛋白质与药物分子之间相互作用各种亲和分析（Pull-down，Co-IP，生物素-亲和素系统等）酵母双杂交/酵母三杂交串联亲和纯化（TAP)噬菌体展示文库筛选化学蛋白组学方法蛋白质芯片相互作用数据库常用蛋白质相互作用的研究技术1GST融合蛋白进行Pull-down

（1）原理细菌表达的谷胱甘肽s-转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，可以采用GST融合蛋白Pull-down。该方法只是用于确定体外相互作用。

两种应用：

1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用

Three-dimensionalstructureofonemonomerofhumanGSTP1-1withGSHbound.GST-谷胱甘肽相互作用GSTpull-down蛋白纯化GlutathionecolumnGlutathionebeadGSTfusionprotein/media/ez-detect_pulldown_assay.gifGSTpull-down蛋白相互作用GSTPull-down方法：

1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）

2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应（4ºC2h）

3）离心弃上清

4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，离心

5）取上清进行SDS电泳，

6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。（在体）其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。2免疫共沉淀Co-IP工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY利用westernblot确定捕获蛋白通过质谱确定捕获的蛋白收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°c，最大转速离心30min后取上清；取少量裂解液以备westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°c缓慢摇晃孵育过夜；取10μlproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；将预处理过的10μlproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中,4°c缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4°c以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；SDS,Westernblotting或质谱仪分析。实验步骤实验注意事项

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（np40或tritonx-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（

SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

(3)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

(4)要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

ColumnCoIPColumnCoIPhttp://优点相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。Summary3.酵母双杂交系统目录ReporterGeneBaitProteinBindingDomainPreyProteinActivationDomainTwohybridproteinsaregeneratedwithtranscriptionfactordomainsBothfusionsareexpressedinayeastcellthatcarriesareportergenewhoseexpressionisunderthecontrolofbindingsitesfortheDNA-bindingdomainTheTwo-HybridSystemReporterGeneBaitProteinBindingDomainPreyProteinActivationDomainReportermRNAReportermRNAReportermRNAReportermRNAReportermRNAInteractionofbaitandpreyproteinslocalizestheactivationdomaintothereportergene,thusactivatingtranscription.Sincethereportergenetypicallycodesforasurvivalfactor,yeastcolonieswillgrowonlywhenaninteractionoccurs.Principleofyeasttwo-hybridsystem研究對象未知蛋白ConstructtargetplasmidandbaitplasmidTransformationScreeningDNAextractionDNAsequencingMajorstepsYeasttwo-hybridsystem酵母双杂交系统的应用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）分析未知蛋白相互作用（三）绘制蛋白质相互作用系统图谱优点在酵母细胞内用作诱饵蛋白的真核生物蛋白更有可能正确折叠和进行翻译后修饰，研究方法接近于体内环境，无需蛋白分离纯化等步骤，可检测瞬时、不稳定的两两相互作用，整个过程只需要基因操作，方法简便，灵敏，高效，很容易实现蛋白质相互作用的高通量自动化分析。缺点(1)不能研究具有自激活特性的蛋白质；(2)只能检测两个蛋白间的相互作用；(3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；(4)大部分实验中有将近50%的假阳性率，且推测的相互作用仅有3%在两种以上的实验中得到验证。Myriad’sProNetTwo-HybridProcessIndustrial-scaleapplicationoftheyeasttwo-hybridsystemRoboticizedbaitcreationprocessCustomactivationdomainlibrariesEfficientmatingstrategyAutomatedforqualityandthroughputPositivesampletrackingRobotsformediapreparation,liquidhandling,colonypickingStatisticalqualitycontrolProNetProcessFlowchart102610111317916155192021252924353638184127434549505462484653525958476361603078312143439575632375122442334440282364553126SeqSeqSeq12341BaitConstruction2BaitVerification3Two-HybridScreen4IdentificationandConfirmationofInteractionsCD19Actin

CytoskeletonPDK1PI3Kg(p110)BtkWISHCAPDblCamKIINdkBcdc42CD22FynSOS2CD19BtkActin

CytoskeletonSOS2WISHCAPDblCamKIINdkBcdc42PDK1CD22FynPI3Kg(p110)1907019767553996671538463351485673251354267720894430263269683064262Sam68Protein4.1GAIPCbl-b4串联亲和纯化（TAP)该方法选用了两个连续的标签进行相互作用蛋白的纯化。标签分三部分：蛋白A，CBP(calmodulinbindingpeptide，钙调素结合多肽)和中间连接的TEV酶识别的酶切位点。A:标签中的ProteinA

与固化的IgG

结合，缓冲液淋洗去除不能结合的杂蛋白，TEV酶切分离ProteinA

和靶蛋白；B:利用CBP(Calmodulinbindingpeptide)-Calmodulin

的相互作用进一步纯化复合物，缓冲液洗去杂蛋白。加入过量的螯合剂(EGTA)螯合Ca2+，使纯化的复合物与层析柱分离。优点(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体；(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；(3)TAP采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性。Isolationofsignaltransductioncomplexesusingbiotin

andcrosslinkingmethodologies

Proteomics2007,7,2371–23745化学交联AlkaliconditionBiotinylation:Preferentialbiotinylation:underacidicreactionconditionsCrosslinking:Chemicalcross-linkingofproteins,anestablishedmethodinproteinchemistry,hasgainedrenewedinterestincombinationwithmassspectrometricanalysisofthereactionproductsforelucidatinglowresolutionthree-dimensionalproteinstructuresandinteractingsequencesinproteincomplexes.theaimofintermolecularcross-linkingbetweendifferentproteinsistoanswer,whichcomponentsinteractandhowandwheretheyphysicallycontacteachother.dithiobis(succinimidylpropionate)(DSP):Methdologicalsignificance:6噬菌体展示技术融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体展示技术特点： 将基因型与表型联系起来 将选择性和扩增性联系起来噬菌体展示的基本原理

在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。

利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317.

1985年Smith首次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。

1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g融合展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science,1990,249:386.噬菌体展示文库噬菌体展示肽库噬菌体展示抗体库噬菌体展示cDNA文库噬菌体展示文库用于蛋白质相互作用研究配基固相化（抗体，膜受体，酶以及其他功能蛋白）文库淘洗（结合－洗脱－扩增）噬菌体富集监测序列测定相互作用验证优点噬菌体展示系统在筛选蛋白质相互作用时更为简便，高通量，适合于不能用酵母双杂交进行筛选的膜蛋白和转录因子，无需了解被研究蛋白的结构信息筛选过程中通过改变筛选条件可以直接评价相互结合的特异性缺点蛋白在宿主菌中有时无法正确折叠或修饰构建的融合蛋白可能改变天然蛋白的结构和功能，影响蛋白质的活性是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。7蛋白质芯片(proteinchip)原理其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。如采用双抗夹心的形式，可通过机械点涂的方法，将多种不同的单克隆抗体点样固定在固相介质表面，如PVDF膜上，制备成抗体蛋白芯片，与制备的多种抗原样本杂交、结合，芯片上的抗体捕获相应的抗原，然后再与标记的多种不同的抗体杂交，由于抗原具有多价结合表位而结合标记抗体，根据杂交信号的有无、多少而进行定性、定量的分析。优势蛋白芯片除了可以研究蛋白间的相互作用外，还可以研究蛋白-脂类、蛋白-核酸以及蛋白-配体间的结合，但目前应用还不够广泛，仅用于CaM、磷脂相互作用蛋白、结构域之间以及抗原与抗体的相互作用研究等。8蛋白质相互作用数据库

Curr

Opin

Struct

Biol2003,13:377THEDIPDATABASEDatabaseofInteractingProteinsTheDIPdatabasecatalogsexperimentallydeterminedinteractionsbetweenproteins.DIP相互作用的表达

NucleicAcidsResearch,2000,28,289－291BIND：theBiomolecularInteractionNetworkDatabaseNucleicAcidsResearch,2001,29,242-245总结第二部分：蛋白与药物分子相互作用方法亲和色谱平衡透析，超滤等理化方法酵母三杂交系统化学蛋白组学方法噬菌体展示技术1酵母三杂交系统ProteinextractionSeparationbyaffinitychromatographyCollectionofTargetproteinsProteindigestionMS/MSDatabase