DB14∕T 1518-2017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法

DB14山西省质量技术监督局发布 1 1 1 2 2 2 3 3 4 7 8 1晋汾白猪种质分子鉴定SSR标记法本标准规定了利用SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴定的原理、试验准备、步骤、判定依据和结果表凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适），2DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点。5试验准备5.1实验仪器设备凝胶成像系统、PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌5.2试验所用试剂血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸银、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、无水碳酸钠、5.3溶液配置溶液配置方法见附录A，除另外说明外，附录A中仅使6.1.2采集个体应具备晋汾白猪品种的典型特6.1.3样品采集时应详细记录材料名3使用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的用于畜禽微卫星DNA遗传检测的标记6.5.1利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。6.5.2扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。6.6.2应用GENEPOP软件进行数据分析并进行聚类7.3品种间差异位点数=0，判定为疑检测位点数为，差异位点数为，判定为遗传相似度为，位点缺失率为，判定为4A.1.1血液裂解液1—A.1.2组织DNA提取液5—A.1.3精子裂解液12—A.1.4精子洗涤液5取1mol/LNaCl37.5mL，0.5mol/L的EDTA5mL，加双蒸水至250mL。高压A.1.61mol／LTris-HCL溶液60.55gTris-base溶于适量水中，加1A.1.70.5mol／LHCL溶液A.1.8氯仿-异戊醇（24:1）A.1.9TE缓冲液A.1.10蛋白酶K贮存液（20mg/m200mg蛋白酶K溶于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1mL,-A.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制A.2.130%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：A.2.66x加样缓冲液A.3银染试剂的配制6A.3.2染色液A.3.3显影液7B.1.1.2加入蛋白酶K至终浓度100μg/mL，混匀B.1.1.6弃去上清液，加入75%乙醇1mLB.1.2.1取0.1g左右组织于1.5mL离心管中，用眼科手B.1.2.2加入500μL组织B.1.2.3加入蛋白酶K至终浓度150μg/mL，混匀B.1.2.4以下步骤同A.1.1.3B.1.3.1用灭菌水洗涤毛发，置于1.5mB.1.3.2加入50μL组织DNA裂解液，同时加入RNA酶至终浓度为20μg/mL充分混B.1.3.3以下步骤同A.1.1.2B.1.4.1取冻精2支或新鲜精液0.5mL，置于1.5B.1.4.2加入等量精液洗涤液，4500r/B.1.4.4以下步骤同A.1.1.2B.2.1.1配置1%琼脂糖凝胶，取2μLDNA，进行电泳检测，DNA条带B.2.1.2取2LDNA样品，用ND1000分光光813253AACCTTCCCTTCCCAATCAC4AGTGGTCTCTCTCCCTCTT5CCAAGACTGCCTTGTAGGTGCTATCAAGTATTGTACCAT64778ACTCACAGCTTGTCCTGGG91TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGAAAGTGGAAAGAGTCAATGGCTAT8TAGCCTGGGAACCTCCACACGGCACCAGGAATCAGCAATCx2GCACTTTTAACTTTCATGAAGAAATTAGTGCCTCAAAT6AGCCCACCTCATCTTATCTACACT9TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTTTGGGTGGGTGCTGAAAAA66TTGTCTTTTTATTTTGCTT1AATGCATTGTCTTCATTCAACCAGAAAGCAATTTGATTTGCATAATCACAAGGACCTACTGTATAGCACAGGATCCAAATGCTGCAAGCG2AGAAATTAGTGCCTCAAATTGGAAACCATTAAGTCCCTAGCAAA6AATGTCACCTTTAAGACTTGGGAATGCGAAACTCCTGAATTAGC873ATCAGAACAGTGCGCCGTAAGTACCATGGAGAGGGAAATGACATGGTTCCAAAGACCTGTGTGAGAGGTCAGTTACAGAA95CATATTTTTCTGCATAACTTGPCR反应体系及程序在冰上按照表D.1所列成分和用量，顺序依次加入PCR管，准备表D.1PCR反应体系（单样品正极槽（下槽）中加入1×TBE缓冲液600mL，在负极在固定液中定影2min。用1.5L双蒸水漂洗2min。F.1等位基因频率pi等位基因频率pi按公式(F.1)计算：pi=P+ΣHi...................................pi——某一等位基因的频率；P——含有某一等位基因的纯合子的频率；F.3.1遗传杂合度h按公式(F.3F.3.2平均遗传杂合度H按公式(F.4)计算。hj/r(F.4)Phj第j座位的遗传杂合度。F.4.1多态信息含量PIC按公式(F.5)计算。PIC=1-(F.5)pi——第i个等位基因的频率；pj——第j个等位基因的频率；一般来说，当PIC>0.5时，该座位为高度多态；0.5>PIC>0.25时，为中度多态；PIC<0.25时，为GGT-HS)HT(F.6)qij——第i个群体在某标记位点上第j个等位基因的频率；rj——该座位上第j个等位基因在总群体中的平均频率。F.6Nei氏标准遗传距离DSNei氏标准遗传距离DSDs按公式(F.7)计算：I=Jxy(JxJy),,,,XijX群体中第j个座位上第i个等位基因的频率；Y群体中第j个座位上第i个等位基因的频率；mj——第j个座位上的等位基因数；F.7