基因敲除-文档

基因敲除一、基因敲除技术简介二、基因敲除方法三、基因敲除技术的应用前景一、基因敲除技术简介

基因敲除(geneknockout)又称基因打靶(genetargeting)是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。它是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的,具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点,目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。一、基因敲除技术简介:基因敲除是通过一定的途径使机体内特定的基因发生突变或缺失的技术,通过观察基因缺失引起的表型变化,进而推测该基因的生物学功能。早期的基因敲除主要是利用DNA同源重组原理,通过设计同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。基因敲除原理一、基因敲除技术简介

研究现状:至今，科学家们已经分别敲除了一万多种小鼠基因（约占所有基因的一半），搞清了许多基因的功能，并建立起了五百多种动物疾病模型。这对疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗来说具有重大意义，也为改造生物、培育新的生物品种提供了可能性。在人类基因组序列分析的结构基因组学的研究完成后,基因敲除将成为在功能基因组学研究中最直接和最有效的方法之一。二、基因敲除的方法传统基因敲除方法利用同源重组应用随机插入突变特点:依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低(低于10－6)。增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用特点:可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段该基因敲除(geneknock－out)技术,是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组,能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上,从而达到改变细胞遗传特性的目的。利用随机插入突变进行基因敲除。大规模的随机插入突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因目。二、基因敲除的方法新兴的基因敲除技术：1.利用RNA干扰引起的基因敲除RNA干扰(RNAin-terference，RNAi)是RNA依赖的基因沉默现象，是双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。2.锌指核酸酶基因打靶技术该技术是将特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白，利用ZFNS（锌指核酸酶）人为造成特定基因位点的DNA双链切口(Doublestrandsbreaks，DSB),再利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，从而实现高效率的基因定点修饰。二、基因敲除的方法

3.利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作，如敲入(Knock－in)、敲出(Knock－out)或点突变。

4.Cas9基因敲除技术主要由细菌和古细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成，II型CＲISPＲ/Cas9免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。二、基因敲除的方法

CRISPER/Cas系统的由来:CRISPR（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统，该系统可以介导外源DNA的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。2002年，Jansen等将其正式命名为CRISPR，基因编码的蛋白质统称为CRISPR附属蛋白（CRISPR-associationproteins，Cas）。CRISPR/Cas系统的分类:TypeⅠTypeⅡTypeⅢ三种不同类型TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。CRISPR/Cas的基因座结构3'端为CRISPR基因座,由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats)顺序排列组成5'端为tracrRNA基因中间为一系列Cas蛋白编码基因,包括Cas9,Cas1,Cas2和Csn2Cas9蛋白包含两个功能结构域,一个在N端,有类似于Rucv核酸酶的活性,一个在中部有类似HNH核酸酶的活性。编码tracrRNA(trans-activatingcrRNA),其指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体,进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复合体,发挥识别和降解入侵的外源DNA功能CRISPR的高度可变的间隔区(spacer)获得视频:芥末生化堂-CRISPR_标清.flvCas9HNH结构域切割互补DNA链,而RuvC样结构域切割非互补DNA链CRISPR/Cas系统的影响因素Cas9对系统的影响

tracrRNA和crRNA在DNA识别的过程中是必须的,可能是参与tracrRNA与目标DNA定向结合tracrRNA对系统的影响tracrRNA保留23-48bp的序列就能够支持Cas9催化的DNA切割。crRNA5’端截短10个碱基将会导致切割失败,而从3’端截短10个碱基不影响切割。tracrRNA和crRNA完整性对系统的影响Protospacer准确性对系统的影响Protospaer序列越靠近3’端准确性越重要PAM对系统的影响CRISPR/Cas9技术应用进展·位点特异性基因编辑平台·利用Cas9系统在转录水平对基因表达的调节·对目标RNA序列进行操纵·对基因组功能进行筛查·作为DNA特定位点标签·实现对基因的诱导调控三、基因敲除技术的应