第十一章 DNA损伤反应课件

第十一章DNA损伤反应第十一章DNA损伤反应自发突变诱发突变化学物质和射线。损伤的DNA在其复制或分离前得到修复，因此基因序列上的改变极少会传递到子细胞中。细胞内存在感应蛋白，能够对基因组进行扫描，探测DNA的损伤，招募特定的酶来进行修复。——不影响细胞功能第十一章DNA损伤反应如果DNA的大面积损伤并且不容易修复，损伤感应器能触发更为广泛的反应，称为DNA损伤反应。细胞内信号通路被激活，传递损伤信号到各种效应蛋白。DNA修复酶量增加，细胞周期调控系统抑制蛋白。阻断细胞周期进程。DNA损伤反应的这条支路有时被称为DNA损伤检验点。如果损伤得以修复，细胞周期阻断会被去除，细胞增殖继续进行。第十一章DNA损伤反应ATR和ATM是DNA损伤反应核心的蛋白激酶当损伤不能被修复时，使细胞周期持久停滞或细胞死亡。ATR或ATM激活，p53触发很多靶基因的表达增加，使细胞周期停滞以及凋亡第十一章DNA损伤反应DNA损伤反应成分的缺失，可导致在人的疾病的发生。自发的DNA损伤也可不可避免地会导致损伤DNA的积累，最终产生能导致不合适细胞行为的突变。DNA损伤反应成分的突变，如ATR,ATM,Chk1,Chk2和p53通常导致对DNA损伤敏感性增加，并增加发展为癌症的可能性。第十一章DNA损伤反应第一节DNA损伤的探测和修复第十一章DNA损伤反应一、DNA损伤的方式单链断裂水解分裂可产生嘌呤核苷酸上碱基的丢失。代谢副产物和环境化学物烷化不同部位的DNA碱基。双链断裂离子放射如X-射线化学物如博来霉素等双链断裂特别有害，因为DNA损伤修复装置能偶然性地将来自不同染色体暴露的DNA末端融合到一起，导致染色体重排。第十一章DNA损伤反应二、核苷酸损伤的修复（一）、单链断裂：未损伤的链。去除DNA损伤部分，并以未损伤的DNA链作为模板进行正确地重新合成，而很容易地得到修复。碱基切除修复核苷酸切除修复第十一章DNA损伤反应两大修复系统：碱基切除修复能在碱基结构上找到相对微小的变化——如脱氨作用和碱基的甲基化——并进行修复。该系统成分能将每一个碱基翻转出螺旋以检查是否异常，从而对DNA进行扫描。当发现有改变的碱基时，可将其从DNA骨架上去除，然后将无碱基链的糖-磷酸骨架去除。DNA聚合酶以未损伤的链作为模板，添加新的核苷酸。DNA链上的缺刻由DNA连接酶封闭。第十一章DNA损伤反应负责探测与修复那些改变双螺旋构型的大片DNA损伤突变。包括嘧啶二聚体或DNA被苯并芘等大化学物的烷化。核苷酸切除修复装置对DNA进行扫描以搜索大的螺旋弯曲，然后利用核酸酶和DNA解旋酶去除伸出的短损伤链。再利用未损伤的链作为模板合成新链，从而修复原始序列。两大修复系统：核苷酸切除修复第十一章DNA损伤反应当双链断裂发生在DNA上时，暴露的末端通常被核酸酶切除，产生单链突出。不精确修复：有些情况下，这些损伤末端可被处理成平端，由非同源末端连接进行重新连接，产生新的DNA分子，它比原始序列缺少好几个核苷酸。二、核苷酸损伤的修复：（二）、双链断裂：第十一章DNA损伤反应精确修复：同源重组。来自断裂DNA的单链末端伸入到姊妹染色单体或同源染色体的同源序列。入侵的链沿着同源模板延伸，以同源染色体作为断裂链模板进行修复。这样产生的修复的DNA分子，其上的损伤区域被来自姊妹染色单体或同源染色体的序列所取代。二、核苷酸损伤的修复：（二）、双链断裂：第十一章DNA损伤反应第二节DNA损伤反应：ATR和ATM第十一章DNA损伤反应很多DNA损伤形式可以得到快速修复，不需要触发DNA损伤反应，引起细胞周期停滞。然而有些损伤，范围特别大或者很难修复—如当姊妹染色单体不能进行重组型的双链断裂修复时，或当双链断裂伴随着大范围的核苷酸改变时。这些情况下，需要靠招募蛋白激酶ATR和ATM中的一个或两个到损伤位点来启动特定的损伤反应。这些激酶通过磷酸化各种也聚集在损伤位点的蛋白来激活损伤反应。DNA-----ATR/ATM（感应激酶）----Chk1和Chk2（效应激酶）ATR：为核苷酸损伤，复制叉停滞，双链断裂等多种形式的DNA损伤反应所必需ATM：特定针对双链断裂的反应。第十一章DNA损伤反应ATR能特定识别单链DNA区域：突变切除、复制叉停滞等形成单链DNA区域单链DNA与单链结合蛋白RPA：RPA包被单链DNA，随后招募ATR。一、ATR对于DNA损伤反应是必需的ATR正常定位于整个核内；放射导致ATR集中于损伤位点处。细胞用小干扰RNA处理，抑制RPA在细胞内的合成。RPA蛋白的下降阻碍了ATR被招募到DNA损伤位点，从而阻断损伤反应。第十一章DNA损伤反应细胞在S期比在G1期哪个对DNA损伤更为敏感？G1期：某些形式的微小的DNA损伤，如甲基化和UV诱导的嘧啶二聚体，触发很小的或不触发ATR反应，可能是因为不产生大的单链DNA。S期：这些损伤能够激活ATR并启动损伤反应，可能是因为复制叉受到延迟或停滞在损伤位点，形成大范围的单链DNA。第十一章DNA损伤反应

二、ATM与双链断裂的反应对DNA双链断裂的反应通常起始于与MRN复合物的结合，其中心成分Rad50与cohesin和condensin的SMC蛋白相关。MRN的Nbs1亚单位招募蛋白激酶ATM，使ATM从无活性的二聚体转化为有活性的自主磷酸化的单体，从而启动损伤反应。第十一章DNA损伤反应对双链断裂的反应在细胞周期中差异很大，主要是由于在某种程度上受到Cdk活性的启动。S,G2,M：DNA断裂不仅可导致ATM反应，同时Cdk活性较高，MRN复合物催化断裂双链的切除能力增强，产生单链突出，诱发ATR依赖的损伤反应，启动同源重组修复。G1：Cdk活性较低，双链断裂切除受到抑制，从而阻碍ATR反应并抑制重组修复。MRN复合物与其他修复蛋白一起，指导非同源末端连接对双链断裂进行修复。

二、ATM与双链断裂的反应对双链断裂的反应也存在细胞周期中的差异第十一章DNA损伤反应第三节DNA损伤反应：接头蛋白和Chk1及Chk2第十一章DNA损伤反应ATR与ATM结合到DNA损伤位点伴随着很多其他蛋白招募到DNA周围。这些成分一起形成大的多蛋白复合物，能帮助招募与协调修复DNA的酶类。这些复合物也能结合并激活另外两类蛋白激酶Chk1和Chk2，它们将损伤信号传递给细胞周期调控系统成分，导致细胞周期进程延迟。接头蛋白和Chk1及Chk2第十一章DNA损伤反应接头蛋白9-1-1和Rad17-RFC9-1-1复合物：三个亚基组成，形成指环围绕损伤的DNA，它为ATR介导的DNA损伤反应所必需，似乎也能通过修复蛋白促进损伤处理进程。

Rad17-RFC：滑钳装载体的修饰形式，Rad17-RFC为9-1-1复合物装载到损伤DNA上所必需第十一章DNA损伤反应芽殖酵母中ATR依赖的切除双链断裂反应过程起始于ATR-ATRIP结合RPA——招募9-1-1复合物装载在或靠近邻近5’-缺口的DNA结构上。ATR磷酸化9-1-1复合物成分。接头蛋白Rad9形成寡聚体与损伤位点结合，结合可能通过与ATR、磷酸化的9-1-1复合物或修饰的组蛋白的相互作用。ATR磷酸化Rad9，因而在Rad9上形成激酶Chk2的结合位点。随后Chk2被ATR磷酸化，也能自身磷酸化，导致自身激活并脱离复合物。接头蛋白将DNA损伤与Chk1和Chk2的激活相联系第十一章DNA损伤反应

第四节DNA损伤反应：p53的激活第十一章DNA损伤反应一、p53与细胞增殖的长期抑制p53是基因调节蛋白，能够直接结合到靶基因的启动子区，改变它们转录起始的速率。大部分情况下，p53促进靶基因的表达，p53激活的总体结果是增加了抑制细胞周期进程，或促进凋亡的蛋白产量。同时，p53抑制了一些靶基因的转录，尤其是那些编码抑制凋亡的基因。因此p53作用的结果是细胞周期停滞或细胞死亡，这要视细胞类型和其他因素而定。第十一章DNA损伤反应p53在DNA损伤和其他的细胞应激反应中具有核心重要的地位，其激活能引起细胞的死亡。因此p53须经历非同寻常的一系列大的调节修饰来确保只有在需要时才存在并具有活性。当DNA损伤时，大部分的这些修饰增加了其浓度或其内在的基因调节活性，或两者兼而有之。第十一章DNA损伤反应二、p53的主要调节因子Mdm2：E3泛素-蛋白连接酶，能泛素化数个靠近p53羧基端的赖氨酸残基，从而将其在蛋白酶体内降解。在没有DNA损伤的时候，Mdm2与p53结合在一起，保持其最低的浓度。当DNA损伤发生时，很多机制降低了Mdm2的活性，因而稳定了p53。P300：组蛋白乙酰转移酶，在DNA损伤反应中p300与p53结合，通过将组蛋白乙酰化产生更开放的染色质结构，帮助促进局部基因的表达。在没有损伤的情况下，p300也能乙酰化p53上被Mdm2泛素化的相同赖氨酸。这些赖氨酸的乙酰化阻断了它们的泛素化，因而进一步确保损伤反应中p53的稳定。ARF：它能结合Mdm2，抑制p53降解。第十一章DNA损伤反应三、损伤反应激酶磷酸化p53和Mdm2DNA未损伤：

Mdm2将p53泛素化，从而促进其被蛋白酶降解。、少量的p53靠核输出与靶基因隔离。第十一章DNA损伤反应三、损伤反应激酶磷酸化p53和Mdm2DNA损伤：ATR/ATM和Chk2磷酸化Mdm2和p53，破坏了它们之间的联系，使p53稳定并被激活。激活的p53四聚体阻断了自身的核输出，进一步增加了其在核内的水平。p53的磷酸化也增强了与转录蛋白的相互作用，包括组蛋白乙酰化酶p300。第十一章DNA损伤反应第五节DNA损伤与起始点转换进程第十一章DNA损伤反应脊椎动物细胞中DNA损伤触发G1期停滞不同物种中，DNA损伤的效应在每一个转换点都存在差异：停滞在G1期是哺乳动物中DNA损伤的主要效应，而有丝分裂进程的延迟在酵母中更为重要。损伤反应可以分成两个阶段1，快速反应期：可以在损伤的数秒钟之内发生，由关键的细胞周期调节因子的磷酸化状态的变化来介导。2，延迟或维持期：激活p53监控起始点转换进程的调节蛋白表达的增加。第十一章DNA损伤反应DNA损伤对起始点转换进程的影响双链的断裂：降解Cdc25A：Cdc25A正常情况下通过将Cdk2上的抑制性酪氨酸残基去磷酸化。使cylinE-Cdk2和周期蛋白A-Cdk2在起始点激活。Cdc25A的降解使Cdk2发生抑制性磷酸化，阻断起始点转换进程。ATM激活也引起p53的稳定和激活，使编码Cdk抑制因子p21的基因表达增加，p21进一步抑制了Cdk活性并帮助维持长期的细胞周期停滞。第十一章DNA损伤反应很多细胞类型中，对DNA损伤和p53激活的长期反应是由凋亡引起的细胞死亡。数个p53靶基因编码的蛋白能促进凋亡或抑制存活因子信号。其中主要的是编码蛋白PUMA的基因，该蛋白是凋亡调节因子Bcl-2家族的促凋亡BH3-only成员。另外，p53本身也拥有BH3样活性，能通过直接激活Bcl-2家族的促凋亡成员而启动细胞死亡。第十一章DNA损伤反应第六节DNA损伤与有丝分裂的进入第十一章DNA损伤反应当DNA损伤发生在S期或G2期时，有丝分裂的进入会被阻断，直到损伤被修复，这样就确保细胞不会作出潜在危险的尝试来分离损伤的染色体。大部分真核生物中DNA损伤反应通过阻断有丝分裂周期蛋白-Cdk1复合物来起作用第十一章DNA损伤反应人细胞S期或G2期的DNA损伤也能通过稳定并激活p53来促进将细胞周期的长时间停滞。p53部分通过促进Cdk的抑制子p21的表达起作用。p21能结合并抑制多种类型的周期蛋白-Cdk复合物p53也能促进另一个蛋白，14-3-3σ的表达，该蛋白能通过阻止周期蛋白B-Cdk1的核输入来抑制有丝分裂的进入。第十一章DNA损伤反应第七节对有丝分裂原与端粒压力的反应第十一章DNA损伤反应一、超增殖信号触发了p53的激活当正常细胞，如从小鼠胚胎取出的成纤维细胞，被改造成可过度产生关键的有丝分裂原信号蛋白，如基因调节蛋白Myc或小GTP酶Ras时，显示？？反应？细胞中这些蛋白的过度产生并不引起细胞的过度增殖，而引起细胞周期停滞或凋亡。这种反应有时也叫做超增殖应激反应或癌基因检验点。这提供了一个重要机制，即当细胞出现不正常增殖行为的时候能够将它们从群体中去除。该机制对于阻止癌症是非常重要的，也可认为是肿瘤抑制子或肿瘤监督系统。第十一章DNA损伤反应超增殖信号部分通过激活p53来阻断细胞周期进程或诱导细胞死亡，其机制依赖于称为ARF的小蛋白。在过度的有丝分裂原刺激反应中，ARF的胞内浓度增加。ARF结合并抑制泛素-蛋白连接酶Mdm2，因而减少了p53泛素化和降解的速率。过量表达能被有丝分裂原信号激活的基因调节因子E2F1，E2F1的一个靶基因是编码ARF的基因。第十一章DNA损伤反应超增殖应激反应或癌基因检验点（a）正常的哺乳动物细胞中，有丝分裂原通过各种信号蛋白如Ras和Myc促进细胞分裂，它们的活性能最终导致基因调节因子E2F1和相关蛋白的激活。（b）当细胞在体外培养或被改造成含过度激活的Ras，Myc或E2F1时，过度的有丝分裂信号促发了ARF表达的增加，某些情况下，Cdk抑制子p16INK4a表达也增加。ARF激活了p53，产生细胞周期的持久停滞（复制衰老）或在某些条件下，细胞死亡。第十一章DNA损伤反应二、有丝分裂原刺激的失衡启动复制衰老直接取自小鼠的成纤维细胞在体外进行培养，大约能分裂15次，然后就产生稳定的细胞周期的停滞，称为复制衰老。这种现象主要源自ARF的增加以及随之的p53水平的升高。这些细胞中的衰老被认为是非生理条件引起：有丝分裂原过多或过少，缺乏细胞与细胞的接触，不充分的细胞外基质成分以及不合适的氧气水平。如果将小鼠细胞培养在更接近生理的环境，复制衰老不会出现。第十一章DNA损伤反应第十一章DNA损伤反应Althoughtheself-renewalcapacitymightbeincreasedinagedHSCs,thereisdecreasedfunctionalregenerativecapacity,particularlyunderstressconditions.Importantly,agedHSCshaveanaltereddifferentiationprogrammewithreducedoutputofcommonlymphoidprogenitors(CLPs),whereascommonmyeloidprogenitors(CMPs)areproducedatthesamerateasbyyoungHSCs第十一章DNA损伤反应changedmorphology,

geneexpressionpattern

chromatinstructure

activatedDNAdamageresponseThetwomainformsofcellularsenescence:ReplicativeinducedsenescenceStressinducedsenescence第十一章DNA损伤反应Replicativeinducedsenescence细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。端粒长度在很多细胞代数后的逐步丢失,导致了在端粒上加帽蛋白的退化。人类细胞中端粒功能最终发生障碍，触发了持久的细胞周期停滞.第十一章DNA损伤反应端粒退化与细胞周期停滞端粒的长度由端粒酶维持。但是人类体细胞中通常不表达端粒酶。在这些细胞中，端粒长度在很多细胞代数后的逐步丢失导致了在端粒上加帽蛋白的退化。人类细胞中端粒功能最终发生障碍，触发了持久的细胞周期停滞。原因？由端粒退化所引起的细胞周期停滞部分依赖于DNA损伤反应。哺乳动物暴露的端粒可视为双链断裂，导致与基因组其他地方双链断裂反应一样的ATM的招募和p53依赖的细胞周期停滞的起始。暴露的端粒在有些情况下也含有单链DNA，能激活损伤反应通路的ATR分支。第十一章DNA损伤反应G1:viable,intactchromosomes,minorphysiologicalabnormalities,withadvancedage,theydevelopdegenerativesymptomssoonerthandoage-matchedmicewithwild-typeTerc.G2,G3andsoon:decreasingtelomereslengthchromosomalabnormalitiesandtheydevelopmultipleageingassociateddegenerativedisordersinhighlyproliferativeorgans,aswellasinpost-mitotictissues.第十一章DNA损伤反应原因：ARF：ARF的增加，随之的p53水平的升高P16ink4a：抑制Cdk活性。缺乏ARF或p53的小鼠细胞在遇到非生理培养条件时，不会发生衰老。这种细胞能在培养条件下无限增殖，因此被称为永生化第十一章DNA损伤反应人类细胞中，端粒的功能障碍被认为也促进了p16INK4a的积累，DNA损伤反应导致了p16INK4a的积累，而不是p53的激活。机制不清楚。对端粒缩短的反应，如同超增殖应激反应，是重要的肿瘤抑制机制，它限制了人类细胞的增殖潜力。第十一章DNA损伤反应StressinducedsenescenceItisacommonprogramthatisactivatedbynormalcellsinresponsetovarioustypesofstress.第十一章DNA损伤反应

子女的寿命与双亲的寿命有关；各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命；成人早衰症：平均39岁时出现衰老,47岁生命结束.婴幼儿早衰症：1岁时出现明显的衰老，12~18岁生命结束.Caenrhabditiselegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。衰老基因学说第十一章DNA损伤反应第十一章DNA损伤反应p53:Anti-cancerorAnti-ageingThegenep53hasbeen