《基于质谱的定量蛋白质组技术规程》

T/CIXXXX—2024

基于质谱的定量蛋白质组技术规程

1范围

本文件规定了基于质谱的定量蛋白质组样品量要求，确立了样品采集与保存、蛋白质提取、样品运

输、质量控制、蛋白质酶解及除盐、质谱数据采集的程序，描述了质谱数据分析和数据质量控制的方法。

本文件适用于动植物组织、细胞、细菌、真菌、血清、血浆、各类体液等样品中提取的蛋白质样品。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

定量蛋白质组quantitativeproteomics(QP）

对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。

注：可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理病理等功能，同时

也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。

3.2

蛋白质酶解proteolysis

蛋白质在蛋白酶作用下降解成肽段的过程。

3.3

非标记定量蛋白质组labelfree(LF）

不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号

便可得到样品间蛋白表达量的变化。

3.4

子离子daughterion(DI）

母离子进一步发生反应形成的产物，反应可以是单分子解离，形成碎片离子、离子或分子反应、或

发生了电荷数的改变。

3.5

保留时间retentiontime(RT）

被色谱分离的样品组分从进样开始到色谱柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到

出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用RT表示，常以分钟（min）

为时间单位。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件：

MS：质谱分析法(massspectrometry)

iTRAQ：同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification）

TMT：串联质量标记定量蛋白质组(tandemmasstag）

DDA：数据依赖质谱扫描模式采集(datadependentacquisition）

DIA：数据非依赖质谱扫描模式采集(dataindependentacquisition)

MS1：一级质谱检测(massspectrometry1）

MS2：二级质谱检测(massspectrometry2）

iRT：索引保留时间(indexedretentiontime）

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5样品量要求

根据不同样品类型和检测目标准备足量样品，在条件许可情况下，尽量加倍准备样品量，并做好样

品备份工作，表1为推荐样品量。

表1推荐样品量

样品类型推荐样品量

新鲜动物组织50mg～2g

新鲜植物组织100mg～50g

细菌/真菌菌体50mg～2g

新鲜培养细胞5×106个～1×107个

血清50μL～100μL

血浆50μL～100μL

唾液、羊水、脑脊液100μL～500μL

尿液15mL～50mL

6样品采集与保存

6.1保存样品之前需要对新鲜采集样品进行预处理，去除易对检测结果造成影响的杂质或污染物，如：

残留的血液、培养液、沉淀物、泥土等非目标检测物，需要对组织和细胞进行充分破碎，以提高蛋白质

提取效率，具体要求见表2。

表2样品采集与保存

样品类型样品采集与保存要求

1.1手术切除的人体组织，使用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或无菌生理盐水洗去残留

血液等非目标检测污染物a；

b

1.2其他动物来源组织如肝脏、心脏等可采用灌流方式去血；

1.3如无灌流条件可将组织剪碎后用4℃预冷的PBS或生理盐水去除血液；

1新鲜动物组织1.4将组织剪/切碎成0.5cm3～1.0cm3的小块；

1.5液氮速冻后-80℃保存。

a：血液等组织液中因含多种高丰度蛋白质，会降低蛋白质鉴定数目，应在样品采集阶段决定是否去除高丰

度蛋白质；

b；组织样品需保证新鲜状态下才可进行灌流操作，灌流不适用于冷冻保存或经固定液浸泡的其他不新鲜的

组织样品。

2.1木本植物的花、叶等，草本科植物，藻类，蕨类植物和大型真菌等的柔软组织，推荐样品

量为0.1g～10g；

2.2果实和种子推荐采集样品量为0.5g～10g；

2新鲜植物组织2.3富含杂质或蛋白质含量低的植物样品，如树根、树皮、木质部、韧皮部组织等，应采集样

本量为5g～50g；

2.4应使用PBS或生理盐水清洗干净样品表面泥土等非目标检查污染物，去除其他相邻组织；

2.5取样后尽快液氮速冻后-80℃保存。含水量多的样本，如果实、花等，可先冻干再液氮速冻。

3.13000g离心10min收集菌体；

3细菌/真菌菌体3.2使用预冷的无菌PBS清洗沉淀块三次，离心去除上清液，保留沉淀块；

3.3液氮速冻后-80℃保存。

4.1贴壁细胞：细胞长至90%密度时，吸干净培养基，使用预冷的无菌PBS润洗细胞表面1~2

次，吸干PBS；使用胰蛋白酶消化（需避免过度消化）或使用细胞刮（动作要快）采集细胞；

4℃，300g，5min离心去除上清液；加入预冷PBS重悬细胞后，再4℃，300g，5min

4新鲜培养细胞

离心沉淀细胞，去除上清液；液氮速冻后-80℃保存；

4.2悬浮细胞：采集细胞悬液至离心管；4℃，300g，5min离心去除上清液；经预冷PBS轻柔

重悬细胞成单细胞悬液后，再次离心去除上清；液氮速冻后-80℃保存。

5.1采集血液后放入试管，室温静置30min；

5.2如不能及时处理样品，需将新鲜采集的血液置于4℃冰箱，2h内离心；

5血清

5.3待血液凝结后，2000g离心10min，小心吸取上层淡黄色清液于EP管；

5.4液氮速冻后-80℃保存。

6血浆6.1用抗凝管收集血液，轻柔颠倒混匀5次，室温静置30min；

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样品类型样品采集与保存要求

6.21500g离心10min去除血细胞，吸取上清液至冻存管或EP管；

6.3液氮速冻后-80℃保存。

7.11500g离心10min去除体液中的沉淀，保留上清液至冻存管或EP管；

7唾液、羊水、脑脊液

7.2液氮速冻后-80℃保存。

8.15000g离心30min去除体液中的细胞及尿沉渣，保留上清液至收集管；

8尿液

8.2液氮速冻后-80℃保存。

6.2所有前处理步骤应尽量保证在冰上或4℃下低温操作，并尽可能缩短操作时间以减小蛋白质降解

几率。

6.3制塑剂、聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）等表面活性剂属于污染物，容易影响数据质量，

应避免使用含此类污染物的枪头、EP管或冻存管处理和保存样品。

6.4应使用旋盖密封管或气密性好的容器保存样品，以免液氮速冻或低温保存时因气压变化造成管盖

弹开。不方便存储在EP管或冻存管中的体积较大的组织样品，可采用锡箔纸等材料仔细包装。样品如

需运输，应用封口膜密封管盖。

7蛋白质提取

7.1针对不同样品类型，提取蛋白质的步骤和方法有所不同，需要根据样品类型选择对应方法进行操

作，具体参考表3。

表3样品前处理

样品类型样品前处理备注

1.1低温快速将大块的组织剪或切成小块，使用含1%蛋白酶抑制剂的预冷PBS缓冲液反

复进一步清洗去除血液；

1.2组织块中如含有血管、脂肪等非目标检测物，应尽量剥离去除；

1.3样品吸干后称重并记录；

1.4进一步破碎组织块，可选择液氮研磨、匀浆或加入合适直径的研磨珠后使用组织破

a应尽量充分破

1新鲜动物碎仪将组织破碎；碎和溶解样品，

组织1.5加入蛋白质裂解液溶解破碎样品，部分组织可能较难溶解，可添加蛋白质裂解液后但也需要尽可

在低温下超声破碎，或用涡旋振荡器剧烈振荡，使其尽可能均匀溶于裂解液中。骨能减少不必要

组织等无机盐含量高的组织块最终无法全部溶解，属正常现象。的破碎步骤，以

a：对于大多数组织选用1.0mm直径的研磨珠，纤维类植物样品如单子叶植物的叶子用2mm～3mm，减少样品损失；

茵类用0.5mm，细胞类用0.1mm直径的研磨珠。针对不同的组织类型,珠子的用量不同，如动物组

蛋白质裂解液

织球料比一般为1：1，球和料的体积最少不能少于容器的1/3,最高只能2/3。若发现研磨效果不好，

可以同时加入大小研磨珠配合研磨，另外可适当增加研磨珠数量和研磨时间。的量要加足，建

议按样品重量：

2.1低温快速将大块的组织剪或切成小块，液氮速冻后放入超低温冰箱保存；

裂解液体积（w：

2.2由于植物细胞壁厚，应使用液氮充分研磨破碎为细粉；

v）=1:5～1：

2.3加入蛋白质裂解液溶解样品后，需在低温下（如冰浴）超声破碎，或用涡旋振荡器

2新鲜植物

剧烈振荡（一般每振荡3min需将样品插入冰上静置3min，振荡次数则根据样品溶10添加。即100

组织

解情况随机调整），使其尽可能均匀溶于裂解液中；mg克样品，加入

0.5mL～1mL

2.4由于植物样品次级代谢产物和色素较多，容易干扰质谱检测，因此需要添加如丙酮、

三氯乙酸、甲醇等有机溶剂沉淀样品的步骤来去除色素和次级代谢物、脂肪等杂质。的蛋白质裂解

液。

3.1菌体样品因具细胞壁结构，可采用液氮研磨、超声或高压细胞破碎仪等方法将菌体

沉淀块充分破碎，充分破碎菌体，是提高蛋白质提取效率的关键；

3细菌/真菌

3.2部分细菌（尤以革兰阳性菌为甚）细胞壁非常厚，需要使用较强的破碎条件，如增

菌体

强破碎参数、增加破碎时间、组合3.1b中提到的多种破碎方法以充分破碎样品；

3.3完成破碎后加入蛋白质裂解液，反复震荡以充分溶解样品。

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样品类型样品前处理备注

4.1贴壁细胞长至90%密度时，吸干净培养基，使用预冷的无菌PBS润洗细胞表面1～2

次，吸干PBS后，将培养皿/瓶转移到冰上操作，往培养皿/瓶中直接加蛋白质裂解液，

按每25cm2培养瓶底面积加500μL～800μL体积裂解液，使用细胞刮反复刮下每1×106个细

4新鲜培养

培养皿/瓶中贴壁细胞，收集裂解液于EP管；胞添加200μL

细胞

4.2采集悬浮细胞悬液至离心管，离心去除上清液，经预冷PBS清洗细胞沉淀块后，4℃，蛋白质裂解液。

300g，5min离心去除上清，按每1×106个细胞添加200μL蛋白质裂解液，充分

吹打或涡旋以迅速溶解细胞沉淀块。

5血清5～8体液类样品中含高丰度蛋白质（如：Albumin,IgG,IgG(lightchains),IgA,IgM,可不加蛋白质

6血浆IgD,IgE等），会极大降低质谱对其他中、低丰度蛋白质的鉴定效率，从而得到较低的裂解液，经蛋白

7唾液、羊总蛋白质鉴定数量。若检测目标为中、低丰度蛋白，可选择的方法有两种：质浓度检测后，

水、脑脊液1）采用高丰度蛋白质去除试剂盒，以去除高丰度蛋白质；直接进入酶解

8尿液2）或采用低丰度蛋白质富集试剂盒，以富集低丰度蛋白质。操作环节。

7.2应选择溶解性强的蛋白质裂解液裂解样品，推荐蛋白质裂解液见表4，亦可采购样品溶解效果好、

蛋白质提取效率高、酶解及质谱兼容的商品化蛋白质裂解液。为取得最佳的使用效果，可以适当将裂解

液分装后使用，应尽量避免过多的反复冻融。

表4各种裂解液主要特点、差异和选择

裂解液编号1号2号3号4号5号

细胞组织蛋白质提取裂

1%SDS裂解液4%SDS裂解液1%SDC裂解液8M尿素裂解液水化液

解液

7M尿素，2M硫

1%（w/v）SDS，1%4%（w/v）SDS，1%脲，20mMDTT，

8M尿素，1%

（w/v）蛋白酶抑制（w/v）蛋白酶抑1%（w/v）SDC，1001%（w/v）蛋白酶

（w/v），100mM

配方剂Cocktail，100制剂Cocktail，mMTris/HCl抑制剂

Tris/HCl（pH

mMTris/HCl100mMTris/HCl（pH8.0）。Cocktail，2%

8.0）。

（pH8.0）。（pH8.0）。（w/v）CHAPS，

1%（w/v）SDS。

裂解强度强强强强强

对膜蛋白的提取好较好较好较好非常好

对胞浆蛋白的提取很好很好很好很好很好

对核蛋白的提取很好很好很好很好很好

胞浆磷酸化蛋白提取很好很好很好很好很好

细胞核转录因子提取很好很好很好很好很好

含蛋白酶抑制剂是是否否是

含磷酸酯酶抑制剂否否否否否

不同物种样品兼容性高高高高高

推荐的蛋白质浓度检测去垢剂兼容的

BCA试剂盒BCA试剂盒BCA试剂盒BCA试剂盒

试剂盒Bradford试剂盒

若进行超滤管辅助酶解，

否否否否否

是否需要丙酮沉淀？

若进行非超滤管辅助的

溶液酶解，是否需要丙酮是是否否是

沉淀？

若进行胶内酶解，是否需

否否否否否

要丙酮沉淀？

植物、细菌（革

贴壁细胞、悬浮细兰阳性菌）、真

优先推荐裂解的样品类动物组织、细菌动物组织、细菌（革动物组织、细菌

胞、外泌体、亚细菌、膜蛋白含量

型（革兰阴性菌）兰阴性菌）（革兰阴性菌）

胞器高的样品类型、

难溶性蛋白质

7.3若选择表4中的1号、2号、4号和5号裂解液则按照以下步骤进行操作：

a)需在使用裂解液前新鲜加入终浓度为1mM的PMSF。如需检测磷酸化蛋白，必须加入含磷酸酶

抑制剂的蛋白酶抑制剂化合物。所有步骤都需在冰上或4℃进行；

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b)加入蛋白质裂解液后在冰上裂解30min，每隔10min涡旋震荡样品管20s，可促进蛋白质

从细胞中释放；

c)在4℃，16000g离心30min，收集上清液为样品蛋白质溶液，可进行步骤7.5的蛋白质浓度

测定；

d)此步骤获得的蛋白质样品可直接进行后续实验，也可分装保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步

骤获得的蛋白质样品可直接兼容步骤10.1介绍的超滤管辅助酶解实验流程。

7.4若选择3号裂解液则按照以下步骤进行操作：

a)金属浴95℃，1000rpm振荡5min；对于血液样品，可直接取0.5μL进行酶解步骤的操作；

b)在4℃，12000g离心20min，取蛋白质上清液，可进行步骤7.5的蛋白质浓度测定；

c)此步骤获得的蛋白质样品可直接进行后续实验，也可分装保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步

骤获得的蛋白质样品可直接兼容步骤10.2介绍的快速溶液内酶解实验流程。

7.5若选择1号、2号、3号和4号裂解液应选择BCA法（BicinchoninicAcid）蛋白质浓度检测试剂

盒对测定样品蛋白质浓度，选择5号裂解液则应选择考马斯亮蓝法（Bradford）。通常人和小鼠软组织

样品蛋白质总量/样品重量在0.5%～0.7%为正常蛋白质提取效率，蛋白质总量不低于200μg、蛋白质

浓度不低于1μg/μL说明提取效果较好。

8样品运输

8.1样品如果需要运输，应尽量送往距离最近的实验室进行后续实验操作。

8.2如需低温运送，应使用足够多的冰袋和保温盒，保证整个运输过程中的温度维持在-20℃。

8.3空运时可使用-20℃封闭式冰盒，以防止温度过低而使塑料管变脆破裂。

9蛋白质样品质量控制

使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）对样品进行质检，将所有蛋白质样品取等量（推荐上样量：

20μg蛋白质/样品）加载到凝胶后进行电泳，对凝胶进行考马斯亮蓝染色，脱色至背景透明无色后使用

凝胶成像仪扫描获得样品的完整蛋白质组条带。样品结果判定及对应解决方法见表5。

表5SDS质量控制结果判定及解决方法

SDS结果质检结果判定解决方法

背景干净，可明显分辨蛋白质梯状条带，

在不同分子量间分布均匀，同类样品间蛋

质量高，可继续后续实验操作。/

白质条带整体和局部无明显差异，各泳道

重复性和颜色一致。

蛋白质浓度检测结果不准确，不

样品间的蛋白质条带灰度值差异过大。重新进行蛋白质浓度检测后再次质检。

符合要求。

再次实验，重新提取蛋白质，再次质检判

样品质量存疑，有待再次实验判

同一类型样品蛋白质条带分布差异过大。定是提取不充分导致条带差异过大还是样

定。

品本身存在差异。

蛋白质分布不均匀，出现如：分布在某一

蛋白质提取效率低，提取不充使用较前更强的破碎/裂解条件处理样品后

范围分子量的蛋白质条带过少，或样品条

分。不符合要求。再次质检。

带分布零星且单一。

蛋白质条带中横纹、纵纹较多，或背景较蛋白质样品中盐类等杂质含量使用有机溶剂如丙酮、甲醇沉淀蛋白质后

深，无法清洗分辨出蛋白质梯状条带。高，不符合要求。溶于蛋白质裂解液后再次质检。

无明显梯状蛋白质条带、条带出现拖尾、采集新鲜样品，注意操作手法，重新进行

蛋白质样品发生降解。

主要条带堆积在低分子量区域。蛋白质提取和质检。

10蛋白质酶解及除盐

10.1超滤管辅助的蛋白质酶解（Filter-aidedsamplepreparation，FASP）

10.1.1当使用的蛋白质裂解液为SDS裂解、水化液，或含有PEG及各种表面活性剂（如SDS、CHAPS、

Triton、Tweens、DMSO、NP-40等），应使用FASP方法进行酶解。

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10.1.2采购质谱级品质的试剂耗材进行实验，蛋白质酶解及除盐的试剂配方见表6。

表6非标记定量蛋白质组蛋白质酶解及除盐试剂配方

试剂配方主要溶剂备注

应新鲜配置，现配现用；使用

8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.0～

8M尿素（Urea）缓冲液前充分混匀；操作过程应注意

8.5

温度不可超过37℃。

500mM碘乙酰胺（IAA）500mMIAA现配现用，避光使用。

1M二硫苏糖醇（DTT）1MDTT

50mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）50mMTEAB

金标水

0.5%三氟乙酸（TFA）0.5%（v/v）TFA

0.1%TFA0.1%（v/v）TFA

5%（v/v）乙腈（ACN），0.5%（v/v）现配现用。

平衡液

TFA

0.1%甲酸（FA）0.1%（v/v）FA

溶剂A2%ACN，98%H2O，0.1%FA

溶剂B80%ACN，20%H2O，0.1%FA质谱级乙腈

10.1.3取7.3c）步骤获得的蛋白质50μg～100μg进行酶解。

10.1.4加适当体积的8M尿素，使其终浓度大于4M。

10.1.5加适量体积的1MDTT溶液，使其工作浓度为20mM。

10.1.637℃水浴1小时。

10.1.7待样品恢复至室温，加适量体积500mM的IAA，使其工作浓度在50mM。

10.1.8室温避光孵育30分钟。

10.1.9加入200uL的50mM的TEAB润洗新的V型超滤管（10Kda），12000g离心10min至液体

全部滤下。

10.1.10样品加入超滤管，每管体积不要超过400μL，4℃，12000g离心，单次离心时间不可超过

15min，离心次数视超滤管内残留液体情况而定，直至液体全部滤下。

10.1.11加200μL的8M尿素，4℃，12000g离心润洗样品，单次离心时间不可超过15min，离心

次数视超滤管内残留液体情况而定，直至液体刚好全部滤下；若使用的离心机是定角转子，在每一次离

心前可水平旋转超滤管180°，以使样品得到更充分的润洗。

10.1.12若细胞组织裂解液中含SDS、硫脲、CHAPS、β-巯基乙醇、Triton、DMSO等去垢剂成分，需重

复10.1.10步骤3次～6次，方能去除以上物质的干扰；若使用的裂解液是8M尿素裂解液则重复

10.1.10步骤一次即可。

10.1.13加入200μL的50mMTEAB润洗样品2次～5次，根据步骤10.1.10的离心难易程度调整

离心次数，越难离心的样品应该增加离心次数。

10.1.14将超滤管从旧收集管套中取出，用干净的无粉滤纸将超滤管外的液体吸干，将超滤管放置到

新的收集管套中。

10.1.15依次加入50mM的TEAB和胰蛋白酶溶液。

10.1.16加入TEAB的体积依据所加胰蛋白酶的体积定，使两者体积之和为120μL～130μL。

10.1.17胰蛋白酶溶液可配置为1μg/μL，按照与蛋白质的量比例为1:30～1:50加入，涡旋震荡1min；

10.1.18封口膜封住，放入37℃培养箱过夜。

10.1.19酶解时间8h～16h，不能超过16h。

10.1.20在室温下，12000g离心，转移收集滤下的多肽溶液至干净的EP管。

10.1.21超滤管内加70μL的50mMTEAB，涡旋振荡；在室温下，12000g离心，转移滤下多肽溶液

与步骤10.1.20的多肽过滤液混合。

10.1.22重复10.1.21步骤一次。

10.1.23使用BCA多肽浓度测定试剂盒测定多肽浓度，计算酶解效率（酶解效率=酶解后多肽量/酶

解前蛋白量），酶解效率一般在60%～90%说明酶解效率和多肽回收率较好。

10.1.24使用真空冷冻干燥机冻干缩小样本体积至50μL，转到步骤10.3进行多肽除盐。

10.2溶液内酶解（Insolutiondigestion）

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10.2.1取步骤7.4b)获得的蛋白质10μg～30μg（总体积不能超过20μL），加入终浓度为20mM

的三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP）和终浓度为40mM的2-氯乙酰胺

（2-Chloroacetamide，CAA），金属浴95℃，1000rpm振荡5min。

10.2.2加热结束待样品恢复至室温后，加入15μL的胰蛋白酶与重组赖氨酸酶（Lys-C）混合物；添

加比例为：胰蛋白酶：蛋白（质量比）=1：20、Lys-C；蛋白(质量比）＝1：50，并吹打混匀；混匀，

金属浴37℃，800rpm振荡酶解2h。

10.2.3加入终浓度0.5%的TFA混匀，终止酶解反应，此时会有沉淀出现，20000g室温离心1min，

吸取上清为酶解好的多肽，使用BCA多肽浓度测定试剂盒测定多肽浓度。

10.2.4酶解后样本如不能及时进行后续脱盐处理，可-80℃存放2周。

10.3多肽除盐

10.3.1将步骤10.1.24或10.2.4得到的多肽溶液，取0.5μL～1μL样品点在pH试纸上检测此时

样品pH值，可使用20%TFA溶液条件样品pH值，确保样品pH﹤3。

10.3.2加入100微升质谱级ACN，室温1000g离心1min，以活化C18除盐柱。

10.3.3加入100微升平衡液，室温1000g离心1min，以平衡C18除盐柱；重复此步骤一次。

10.3.4把复溶好的多肽溶液加入C18除盐柱，1000g室温离心1min，使多肽溶液从柱子流出，并检

查多肽溶液是否都穿过柱子，如果溶液未完全穿过柱子，可适当延长离心时间，但不可增加离心力；收

集流出溶液，反复过柱子2次以增加C18对多肽的吸附效果。

10.3.5加入100μL0.1%的TFA溶液，1000g室温离心1min，以滤洗除盐柱，重复滤洗1次。

10.3.6更换新的收集管，加入50μL70%的ACN溶液至除盐柱，1000g室温离心1min，将肽段洗脱

下来；重复一次本步骤，最终样本体积约为100μL，此时得到除盐后的多肽溶液。

10.3.7使用真空冷冻干燥机冻干得到除盐后的多肽干粉，冻干后可于-80℃保存1年。

10.3.8加入10μL～20μL0.1%甲酸重新溶解多肽干粉，经BCA多肽浓度测定试剂盒定量后，各样

品分别取10μg多肽，冻干后等待进行质谱分析。

10.4TMT标记实验流程

10.4.1TMT标记实验

采购质谱级品质的试剂耗材进行实验，TMT标记实验试剂及说明详见表7。

表7TMT标记实验试剂及说明

试剂说明

1M的TEAB用于同量异位质量标签标记实验的10X溶解缓冲液。

50%羟胺10X淬灭试剂，用于TMT实验的胺反应性标记。

是串联质谱标签，设计用于提高样品多通路水平，同时不影响蛋白鉴定和定量。Thermo

TMTpro标记试剂

ScientificTMTpro18plex标记试剂套件实现对多达18份样品的多通路检测。

从-80℃取出标记试剂使其恢复室温，加入ACN，使标记试剂终浓度为20μg/μL。

将步骤10.2.3获得的不同样品的多肽干粉取出7μg多肽后真空浓缩干，然后用4μL0.1M

的TEAB溶解。

将TMT标记试剂顺序打乱，向每一个样本中随机加入2.1μL标记试剂，充分混匀。

25℃金属浴上反应1.5h。

加入0.5μL5%羟胺，混匀后室温放置15min，以终止反应。

每样品各取2μL混合成一管，将混合样品使用质谱仪检测各样品的含量是否一致以及标记

效率是否大于95%，剩余的样品可进行真空浓缩干燥等待除盐。

标记效率大于95%说明标记成功。

10.4.2TMT标记后的多肽除盐

采购质谱级品质的试剂耗材进行实验，TMT标记实验试剂及说明详见表8。

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表8TMT标记后多肽除盐耗材及试剂配方

试剂耗材耗材及试剂配方

除盐柱Sep-PakC181ccVacCartridge50mg

活化液无水甲醇

平衡液80%ACN，0.1%TFA

多肽溶解液2%ACN，0.1%TFA

清洗液2%ACN，0.1%TFA

洗脱液40%ACN，0.1%TFA

用适配的注射器缓慢加入1mL活化液，让活化液从柱子流出，以活化C18除盐柱，去除管

底流出液。

加入1mL平衡液，去除管底流出液。重复此步骤一次。

使用400μL多肽溶解液溶解步骤获得的多肽干粉，将溶解好的多肽溶液缓慢加

入除盐柱，吸取从除盐柱流出的溶液重新缓慢加入除盐柱，以增加C18填料对多肽的吸附效率。

加入1mL清洗液，去除管底流出液。重复此步骤一次，将除盐柱放入新的收集管。

加入200μL洗脱液。重复此步骤一次，此时得到400μL除盐后的多肽溶液。

使用真空冷冻干燥机冻干得到除盐后的多肽干粉，冻干后可于-80℃保存1年。

按照步骤10.6对冻干后的多肽样品分馏。

10.5iTRAQ标记定量蛋白质组蛋白质酶解及标记（以8标为例）

10.5.1蛋白质酶解

蛋白质定量后取20μg～100μg蛋白溶液置于离心管中，如果是血清、血浆等含有非蛋白

氮（Non-proteinamines）的样本，则需要减少样本的总量。

往样品中加入5倍体积预冷丙酮，-20℃放置1小时，充分沉淀蛋白。

4℃，12000g离心10min，取沉淀真空冷冻干燥。

加入50μL的DissolutionBuffer（试剂盒自带）充分溶解蛋白沉淀。

加入1μLDenaturant（试剂盒自带），涡旋混匀。

加入2μLReducingReagent（试剂盒自带），涡旋混匀，60℃反应1h。

低速离心收集管壁液体，加入2μLCysteine-BlockingReagent（试剂盒自带），涡旋混

匀，室温10分钟。

用100μL的50mMTEAB润洗超滤管（10Kda），12000g离心15min，将还原烷基化后的

蛋白溶液加入超滤管中，12000g离心20min，直到超滤膜上没有过剩的液体，弃掉收集管底部溶液（转

速设置不超过使用的超滤管的最高值，单次离心时间不超过15min，离心次数可根据超滤管内残留液

体量实际情况进行调整，直至将所有体离心滤出）。

加入iTRAQ试剂盒中的DissolutionBuffer100μL，12000g离心20min，弃掉收集管底

部溶液，重复3次本步骤。

0更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量1-2μg（与蛋白质量比1：50～1：100），

体积25μL，37℃酶切8h～16h。

1取出超滤管，涡旋1min后，12000g离心20min，将酶解消化后的肽段溶液离心于收集管

底部。

2在超滤管中加入25μLDissolutionBuffer，涡旋1min，12000g再次离心20min，与

上步骤1滤出液合并，收集管底部共得到50μL酶解后的样品（如果体积有损失，加入

DissolutionBuffer调至50μL）。

10.5.2iTRAQ标记

从冰箱中取出iTRAQ标记试剂，平衡到室温，将iTRAQ标记试剂室温低速离心至管底（检查

iTRAQ标记试剂的体积，约为25μL左右）。

向每管iTRAQ标记试剂中加入150μL有机溶剂（加入的有机溶液的体积可以根据样品体积

进行调整，保证其终浓度为70%以上；4标的有机溶剂为乙醇，8标的有机溶剂为异丙醇），涡旋振荡，

室温低速离心至管底。

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取50μL步骤2获得的样品转移到新的离心管中。

将iTRAQ标记试剂添加到样品中，涡旋振荡，室温低速离心至管底，取0.5μL样本检测其

pH值，如果pH小于7.5，可以加入5μL的DissolutionBuffer。

室温反应2h。

加入100μL金标水终止反应。

为了检测标记效率及定量准确性，从8组样品中各取出1ul混合，用Ziptip除盐柱脱盐后

进行质谱鉴定，确认标记反应良好，标记效率应达到98%以上。

把8组标记后的样品进行混合，涡旋振荡，离心至管底。

真空冷冻离心干燥，冻干后的多肽样本可保存于-80℃一年。

0按照步骤10.6对冻干后的多肽样品分馏。

10.6肽段分馏（高pH反相分馏法）

10.6.1将标记好混合冻干后的样本用150μL流动相A（20mM甲酸胺（pH10））复溶，涡旋振荡，

12000g离心20min，吸取上清上样。

10.6.2用Ultimate3000系统连接反向柱（XBridgeC18column,4.6mmx250mm,5μm）进行

高pH分离。

10.6.3准备48个1.5mL离心管，依次标记为1～48，用于收集分离得到的组份1～48。

10.6.4流速设置为0.8mL/min，分离梯度如表9：

表9高pH反相分馏梯度

时间（min）流动相B（20mM甲酸胺（pH10），80%ACN）

05%

55%

3015%

4538%

4690%

54.590%

555%