4.3.1 色谱分析概述

2016-044.3

色谱分析法ANALYSISBY

CHROMATOGRAPHY本节内容概要色谱分析概述气相色谱分析液相色谱分析其他色谱分析方法玻璃柱：色谱柱碳酸钙颗粒：固定相石油醚：流动相

4.3.1色谱分析概述

GENERALINTRODUCTIONTOCHROMATOGRAPHY1903年由俄国植物学家茨维特M.S.Tswett分离植物色素时采用。1903年3月21日为色谱日“Heinventedtheseparationofmoleculeswhichkeepshumansintouch”对色谱方法两相更进一步的认识：流动相：色谱工作时，流过色谱柱的物质。它既可以是气体，也可以是液体，还可以是超临界体。既可以是单质或单一化合物，也可以是一定比例的混合物。固定相：色谱工作时，固定相在色谱柱中固定不动。通常其核心是一类惰性物质，如硅胶、硅藻土等。对于气固、液固色谱法来说，固定相既是惰性物质；对于气液、液液色谱法固定相=惰性物质（载体）+固定液（粘稠的液体或固体有机物）。在载体和固定液之间有物理的涂裹，现多为化学键合。固定液是固定相的一部分，在毛细管色谱柱中只有固定液而没有载体。

色谱法在国民经济和科学研究中的作用上世纪30~40年代为揭开生物世界的奥秘，分离复杂的生物组成发挥了独特的作用。上世纪50年代为石油工业的研究和发展做出了重大贡献。上世纪60~70年代为石化、化学工业等部门的分析检测工具。目前是食品科学、生命科学、医药科学、环境科学等众多研究领域的重要手段和方法。色谱法在分析化学中的地位和作用：高超的分离能力，无可替代，无法比拟。

色谱法分类按流动相物理状态分：

气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC，简称GC）。

液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC,简称LC）．超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。

按分离机理：利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为空间排阻色谱法。

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与分析仪器相关的信息、谱库资源网站http:///http:////chemistry/cas-ser.html谱图由TXT文件中数字模拟生成举例和说明：六六六CAS登录号：608-73-1第1段数码为2-7位，升序排列，数码越大化合物越新，注册登录越晚。第2段为2位数码。第3段位校验码，1位数码，用于判断此登录号是否正确。校验码计算规则：第2段数码最后1位数乘1，第2位乘2；依次第1段数码最后1位乘3，……，乘积相加，和除10，余数为校验码。六六六CAS登录号校验码计算(3×1+7×2+8×3+0×4+6×5)=71÷10=余数1http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi有NMR谱图,及少量的RAMAN,ESR谱图显示的谱图为PNG或JPG格式图片34/scdb/农药有事问名网(农药名网)

色谱流出曲线及主要术语

流出曲线和色谱峰

填充柱色谱分离示意图

如果进样量很小，浓度很低，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：

式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。基线

是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中O-t线．稳定的基线通过电子线路的衰减表面上看似“一条水平直线”

。从色谱流出曲线上，可以得到的重要信息：

◎

根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。

◎根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析。

◎根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。

◎色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。

◎色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。

色谱分析的基本原理色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。

两个组分完全分离的条件两组分的分配系数必须有差异区域扩宽的速率应小于区域分离的速率在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。分配系数K和分配比k分配系数K

分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即分配比k

分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即组分保留值与分配比的关系？如何测量？

分离度

相邻两组色谱峰保留值之差与两个色谱峰峰底宽度总和之半的比值。

R=0.6R=0.8R=1.0R=1.25R应达到1~2，两个组分最好基线分离（1）高柱效，高分离度（2）高柱效，低分离度（3）低柱效，低分离度（4）低柱效，高分离度

塔板理论

最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。塔板理论为半经验理论。式中：n–理论塔板数L–色谱柱长H–每块塔板的高度

塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩散不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。

速率理论

1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论—速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。VanDeemter方程的数学简化式为式中：u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。现分别叙述各项系数的物理意义。涡流扩散项A在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，形象地如图所示。A＝2λdp上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于中空的石英毛细管色谱柱，不存在涡流扩散。因此A≈0。峰右侧为时间记录起点0分子扩散项B/u（纵向扩散项）

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如图18S2所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。B＝2γDg式中γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）。传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即

C＝Cg＋Cl

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度规则的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如H2）做载气，可使Cg减小，提高柱效。液相传质阻力系数C1为由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Dl大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使Cl增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附会造成拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。将上式总结，即可得气液色谱速率板高方程

这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。

填充柱的气液色谱的速率方程：毛细管柱的气液色谱的速率方程：

液液分配色谱的速率方程：因素变化柱效率担体粒度变大？填充均匀提高（H下降）载气密度提高提高（H下降）压力提高提高（H下降）流速提高在某一流速下H极小温度升高？固定液液量下降提高（H下降）粘度下降提高（H下降）影响柱效率的因素

色谱分析定量常用的方法☆面积归一化法（适于高纯度样品；同系物等。）☆内标法（适于常量分析,亦可用于痕量分析）-注意内标物的选择☆外标法（适于痕量分析及HPLC常量分析）内标物种类和使用方法主要有两大类1增塑剂类（常用有邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯等）2正构烷烃类（常用的有C18~C28等）上述两类内标物适用于GC-FID;增塑剂类适用于HPLC-UV。使用（见实验指导书实验五），具体的配制方法：首先依据拟选定的内标物的保留值来确定。接下来要“配重”。配重的含义是分析物与内标物的峰高响应值相近（进样浓度：GC-FID一般为200mv;HPLC-DAD的吸光度值为0.43左右）。然后，配制内标溶液（量要足够多）。用内标溶液分别稀释定容（通常100mL容量瓶）称量的标样（约0.1g）、样品（折算适量）。结果计算举例：1.7.1面积归一法

有一样品色谱流出峰3个，峰1的峰面积134524、峰2的峰面积55678、峰3的峰面积3396，求组分2的百分含量（X2）：据公式解色谱分析标准中通常规定进样规则：在选定的色谱条件下，在反复多次进入标样且每针间色谱峰面积在允许差范围内后，正式进样分析。进样顺序：标、样、样、标。1.7.2

内标法测定化合物A的有效成分含量称取化合物A标准品（含量为99%）0.1012克，在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解，加入内标物为邻苯二甲酸二丁酯（500mg/L）5mL，定容至刻度。称取化合物A样品0.1120克，在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解，加入内标物邻苯二甲酸二丁酯（500mg/L）5mL，定容至刻度。仪器条件：灵敏度：1.5衰减：7纸速：4波长：254nm，进样量皆为10

L测定结果：化合物A标准品平均峰面积为15780，内标物平均峰面积为16890；化合物A样品平均峰面积为13550，内标物平均峰面积为16870。求化合物A样品的有效成分百分含量。解：将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中，化合物A与内标物峰面积之比，分别进行平均。以质量百分数表示的化合物A含量X，按下式计算：

式中：

—标样溶液中，化合物A与内标物峰面积比的平均值；

—试样溶液中，化合物A与内标物峰面积比的平均值；

m1—化合物A标样的质量，g；

m2—试样的质量，g；

P—标样中化合物A的质量百分含量。化合物A的百分含量：1.7.3外标法测定化合物B的有效成分含量称取化合物B标准品（含量为99.8%）0.1008克，在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解，定容至刻度。称取化合物B样品0.2053克，在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解，摇匀定容至刻度。仪器条件：FID。温度（℃）：气化室240柱箱200检测器

250。进样量皆为1

L。测定结果：化合物B标准品平均峰面积为33986；化合物B样品平均峰面积为24399。求化合物B样品的有效成分百分含量。