一文读懂外泌体Exosome【光量分享】

一文读懂外泌体Exosome【光量分享】本文由光量资本冯德元整理汇总液态活检按照检测的对象分类，可以分为核酸水平的ctDNA检测和细胞水平的循环肿瘤细胞（CTC）检测以及外泌体（Exosome）检测。CTC和ctDNA已经有了较为深入的研究，并开发出很多基于CTC和ctDNA检测技术的平台。近几年，对液态活检“三驾马车”之一的外泌体（Exosome）的研究开始变得越发活跃。一、什么是外泌体？外泌体（Exosome）产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30~150nm的膜性囊泡，密度为1.13-1.19g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生1000-10000个。通常1ml血液中存在1×10^12个外泌体。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。二、外泌体研究历程外泌体的发现要追溯到1986年，EberhardG.Trams和R.M.Johnstone在体外培养的绵羊红细胞培养液上清中发现了一种有膜结构的小囊泡，并将其命名为Exosome（外泌体）。但外泌体并未引起足够的重视。1996年，G.Raposo发现类似于B淋巴细胞能分泌抗原提呈外泌体，这种外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明这种B细胞来源的外泌体可以直接刺激效应CD4+细胞的抗肿瘤反应。2007年，H.Valadi等发现，细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。这意味着细胞可以通过外泌体影响另外一个细胞，甚至可以把自己的基因强加给另外一个细胞。研究人员逐渐对小小的外泌体产生了极大的好奇。他们发现，肿瘤细胞的外泌体与正常细胞的外泌体之间存在差异，肿瘤的外泌体会促进肿瘤的生长和转移，肿瘤周围组织细胞分泌的外泌体具备杀伤肿瘤细胞的能力，等等。2013年的诺贝尔生理或医学奖颁给了三位科学家，他们分别是美国科学家JamesE.Rothman和RandyW.Schekman，德国科学家ThomasC.Südhof，以表彰他们发现细胞内部囊泡（外泌体等）运输调控机制。使外泌体的研究达到全新的高度。2015年10月底，康奈尔大学的DavidLyden等发现，他们转移的肿瘤细胞在出发前会先行释放出外泌体，外泌体会到达预期转移的器官，被相应的细胞所摄取，改变这些靶细胞的状态，营造一个适宜转移来的肿瘤生长的微环境。在这其中，外泌体表面的整合素种类决定着靶器官的特异性，例如整合素α6β4和α6β1与肺转有关，而整合素αvβ5与肝转有关。这为抑制抑制肿瘤的转移提供了新的思路。2016年5月，牛津大学开发出一种名为EvOx的外泌体治疗产品，利用人体细胞自身精准通信系统将药物递送到身体的特定部分，以治疗一些目前无法治愈的疾病，包括大脑疾病、自身免疫性疾病以及癌症。EvOx已经获得了由投资公司牛津科学创新（OxfordSciencesInnovation）1千万欧元的资金资助，主要用于临床前和早期临床试验的技术支持。2016年12月，来自美国犹他大学的研究人员在Nature上发表文章报道了自组装蛋白质纳米笼（nanocages）的设计，它们以一种类似于一些病毒的方式从人类细胞释放到小囊泡中。研究人员将这种生物材料称为“包膜蛋白纳米笼”（EPNs），并阐述了蛋白质是如何被编程以指导杂交生物材料的形成，并执行复杂的任务，建立EPNs作为一类设计的、模块化的，遗传编码的纳米材料，可以在细胞之间转移分子。该方法在药物递送方面有很重要的应用前景。2017年，纳米芯片分离外泌体技术成为IBM评选的5种热门技术之一。在过去十年中，IBM每年要求他们的科学家和研究人员智囊团，选择出被广泛应用的最热门的五种技术（5in5）。2017的5in5的榜单着眼于利用纳米技术、人工智能和半导体制造的发展，产生新一代的仪器和工具。三、外泌体的构成截止目前已经通过286项研究，在外泌体中发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。外泌体的膜同细胞一样，是磷脂双分子层。外泌体膜含有MHC-1/2蛋白，能绑定特异性的肽链；还有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。外泌体膜中有膜转运融合蛋白annexins、RAN、GTPases。外泌体膜上有脂质筏Chol、ceramide、SM、PC，限制膜流动，参与包括跨膜信号转导、物质内吞、脂质及蛋白定向分选的多种功能。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63,CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。外泌体中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA；同时还有一些蛋白、脂类也能被包裹到外泌体中。外泌体中常见的细胞质蛋白是Rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，现有大量的研究发现外泌体中含有40种RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白（包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。此外与外泌体产生相关的重要分子有：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。一些物质进入外泌体中是特异性的：如hnRNPA2B1能结合lncRNA或miRNA特异性的序列（GGAG/CCCU），进行主动包埋。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶（GAPDH,烯醇化酶1,醛缩酶1,PKM2,PGK1,PDIA3,GSTP1,DPP4,AHCY,TPL1,抗氧化蛋白,P4HB,LDH,亲环素A,FASN,MDH1和CNP）、核糖体蛋白（RPS3）、信号转导因子（黑色素瘤分化相关因子,ARF1,CDC42,人类红细胞膜整合蛋白,SLC9A3R1）、粘附因子（MFGE8、整合素）、细胞骨架蛋白以及泛素等。四、外泌体：肿瘤转移的器官倾向性肿瘤转移的器官倾向性（OrganotropicMetastasis）指的是某些原发肿瘤特别容易在特定的器官中产生新的病灶。虽然上皮细胞-间充质转化会帮助肿瘤细胞扩散，但是游动的肿瘤细胞仍然需要停靠到一个合适的组织环境，只有这样才可增生成为新的肿瘤。肿瘤通过外泌体可以改造受体组织的微环境，使其更适于肿瘤细胞的生长。由于不同外泌体对不同器官的亲和力各异。肿瘤产生的外泌体更倾向与肿瘤转移位点附近的细胞融合。外泌体之所以能够精确靶向特异的细胞并与它们结合，可能是由于外泌体表面的某些膜蛋白和脂类，特别是与细胞外基质和细胞粘附有关的分子。例如，在最终会转移到肺部的肿瘤所释放外泌体的表面，所具有整合素的种类是a6b4和a6b1。而当整合素类型为avb5时，这些肿瘤便会转移至肝脏。当与靶向组织结合后，这些外泌体还可以激活一系列有利于肿瘤存活的过程，包括细胞外基质的改造和血管生成。五、外泌体影响免疫系统转移的癌细胞要想成功增殖成为新的病灶，需要逃过人体固有和治疗诱发的免疫监视。最新发现显示，肿瘤释放的外泌体可能在免疫调节方面有重要作用。肿瘤释放的外泌体可以通过削弱免疫效应细胞的反应和激发免疫抑制细胞的扩增，来营造一个免疫抑制的环境。例如，实体瘤和白血病患者的外泌体能够导致CD8阳性T细胞的凋亡和调节性T细胞的增生，并降低自然杀伤细胞的细胞毒性。肿瘤释放的外泌体可以替代肿瘤细胞接受免疫系统的攻击，从而帮助肿瘤细胞逃过免疫系统的识别。例如，在某些B细胞淋巴瘤中，表达CD20的外泌体可以截获针对CD20的抗体Rituximab，从而减少抗体与靶细胞的结合。外泌体对免疫疗法的影响将是未来研究的一个重要课题。肿瘤释放的外泌体可以引发炎症，利用基质浸润细胞的反应营造出利于肿瘤生长的微环境。六、外泌体的分离外泌体的分离方法主要有：差速离心、密度梯度离心、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法等。超速离心：耗时耗力，往往需要8-30个小时；每次最多只能处理6个样品；需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。具体步骤为：将欲提取的细胞培养上清液10ml，在4℃的环境下，300×g10min，2000×g20min，弃沉淀，去除细胞；然后l0,000×g30min，弃沉淀，去除亚细胞成分；再用10,000×g60min，弃掉上清液，最后所得沉淀既为exosome，用30mlPBS溶液重新悬浮沉淀物，混匀后再以10,000×g60min，用lmlPBS溶液悬浮沉淀物提纯的exosome溶液分别装入eppendorf管内，置于-80℃冰箱内保存备用。磁珠免疫捕获：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。Exo系列外泌体分离试剂盒：外泌体分离试剂盒通过简单离心，从体液、血液、尿液、细胞中分离外泌体（Exosome），相比超速离心，安全、快速，经过两次柱子纯化，很好的去除了白蛋白，从而获得高纯度和高产量的外泌体。七、外泌体的检测在下游分析方面，分离纯化出来的exosome可以做蛋白分析，也可以做RNA（microRNA和LncRNA）检测。蛋白分析SDS：可分析得到的Exosome中蛋白的含量及种类。Western-Blot：通过Western-Blot可以检测Exosome中特定的蛋白表达情况。2-DE等蛋白组学分析：可以了解Exosome中不同蛋白的表达、数量情况透射电镜通过透射电镜可以分析Exosome的大小、形态等，再结合免疫标记可以很清楚的分析特定指标在Exosome表达的部位。基因水平Real-TimePCR：通过PCR可以分析需要研究的指标的表达量转录组分析：通过测序或者芯片，分析Exosome不同基因的转录水平miRNA：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的miRNA的表达情况，研究特定的miRNAlncRNA分析：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的lncRNA的表达情况，研究特定的lncRNA与Exosome共同调控某种疾病的关系参考引用：一文读懂丨揭开外泌体的神秘面纱转化医学网外泌体解决方案尽在这里诺禾致源外泌体的家谱MedSci关于外泌体，你想知道的都在这儿了……小张聊科研外泌体发展之路bio360外泌体的世界（一）CellMax胎牛血清外泌体：肿瘤转移的先锋部队药明康德关于外泌