34蛋白质工程的原理和应用-高二生物人教版选择性必修3

义县高中刘占江3.4蛋白质工程的原理和应用蛋白质的四级结构

你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画"的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。

最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。从社会中来

那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？逆转录转录DNARNA翻译肽链复制复制折叠等具有空间结构的蛋白质表达生物特有的功能或性状天然蛋白质的合成过程与性状表达温故知新：蛋白质只有具有一定空间结构，才能表达特有性状或具有特定功能4蛋白质的结构三级结构一级结构四级结构二级结构蛋白质的二级结构

---多肽链的盘曲或折叠胰岛素的三级结构---多肽链既盘曲又折叠血红蛋白质的四级结构

---四条多肽链的盘曲和折叠蛋白质工程以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。对蛋白质分子结构的设计和改造是通过蛋白质工程实现的。---第二代基因工程基础：了解蛋白质的结构和功能途径：目的：改造或制造新的蛋白质，满足人类的生产或生活的需要改造基因（基因修饰或基因合成）基因工程与蛋白质工程的比较基因工程实质不足蛋白质工程天然蛋白质的不足目的将一种生物的

转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的

，进而表现出

。基因蛋白质新性状在原则上只能生产自然界已存在的

。蛋白质即天然蛋白质天然蛋白质是生物在长期

过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种

的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。进化生存生产符合人类生产和生活的需要的

。蛋白质一、蛋白质工程崛起的缘由基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质天然蛋白质干扰素治疗病毒感染、癌症。保存半年改变分子结构半胱氨酸

丝氨酸体外保存困难实例1：符合特定物种生存需要不一定符合人类生产、生活需要实例2：赖氨酸含量低合成时需：天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶。浓度影响酶活性苏氨酸(352位）异亮氨酸产量提高天冬酰胺(104位)异亮氨酸改造蛋白质结构改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量提高数倍改造改造满足人类生产和生活的需要二、蛋白质工程的基本原理1、目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。2、原理：改造基因（基因修饰或基因合成）3、流程：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列→合成新基因→获得所需要的蛋白质蛋白质工程的基本思路蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？基因工程是遵循中心法则，DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，创造出自然界不存在的蛋白质思考：天然蛋白质的合成途径：基因表达（转录和翻译）形成氨基酸序列的多肽链形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列(基因)蛋白质工程的途径：（基因工程）遵循中心法则蛋白质工程流程图：蛋白质三维结构氨基酸序列多肽链基因DNA预期功能DNA合成分子设计mRNA生物功能转录翻译折叠从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列资料---蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地

了解蛋白质的二维结构和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。基因定点诱变技术的理解项目内容条件原料酶引物能量ＡＴＰ操作方法ＰＣＲ法结果适应范围后代中半数为诱变的ＤＮＡ分子脱氧核苷酸ＤＮＡ聚合酶和ＤＮＡ连接酶含突变顺序的ＤＮＡ分子片段空间结构完全清楚的蛋白质基因定点诱变技术的示意图思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较比较基因定点诱变基因突变相同点发生的过程结果不同点场所手段方向DNA复制过程中产生新基因，从而产生新性状生物体外生物体内定向改造不定向性PCR技术物理化学方法讨论：怎么样能够写出三种决定“—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—”的脱氧核苷酸序列。写出目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？

GCU~~~UGG~~~AAG~~~AUG~~~UUUACG苏氨酸丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG色氨酸：UGG赖氨酸：AAA、AAG甲硫氨酸：AUG苯丙氨酸：UUU、UUCC（1）每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种，可以根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出mRNA序列为GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。附录：‘思考’答案三、蛋白质工程的应用1、研发速效胰岛素类似物已经在临床上广泛应用天然胰岛素制剂易形成二聚体和六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。研究人员通过分析人胰岛素晶体结构发现，胰岛素B链20-29位氨基酸是形成多聚体的关键区域，改变这个区域氨基酸序列，则可抑制胰岛素的聚合，由此研发的速效胰岛素类似物产品已在临床上广泛应用。2、医药工业方面——鼠—人嵌合抗体人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自小(大)鼠McAb，而恒定区则来自人的抗体。这样的抗体既保持了原来McAb的特异性和亲和力，又大大减少了在人体内的免疫原性。3）治癌酶的改造：疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使一些碱基3’-OH缺乏,从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。HSV—TK催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力提高20倍以上。3、其他工业方面，用于改进酶的性能或开发新的工业用酶1）枯草杆菌蛋白酶常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。利用蛋白质工程获得的该酶突变体已有上百种，从中筛选出优良突变体用于生产提高其使用价值。2）利用蛋白质工程思路来设计微生物农药，通过改造微生物蛋白质结构增强防治害虫效果。4.水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。5．生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。原因：蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构。这种高级结构很复杂，目前对其了解还很不够，还需探索。