分子生物学教案

分子生物学教案分子生物学教案第一章：绪论教学目的：1、了解分子生物学的含义及其研究内容2、了解分子生物学发展简史，掌握分子生物学发展过程中的三大理论发现和三大技术发明教学重点：1、分子生物学的含义2、分子生物学的主要研究内容思考题：1、你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？2、你对分子生物学的现况和今后的发展有何看法？教学内容：一、分子生物学的基本含义分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。二、分子生物学的发展过程分子生物学的发展大致可分为三个阶段。（一）准备和酝酿阶段1、确定了蛋白质是生命的主要物质基础19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，并证明酶的本质是蛋白质。1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。1953年Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子-胰岛素A链和B链的氨基酸全序列分析。2、确定了生物遗传的物质是DNA而不是蛋白质证明DNA是遗传物质的两个关键性实验：首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国的微生物学家Avery.他的实验是用肺炎球菌感染小鼠。美国遗传学家Hershey用T2噬菌体感染大肠杆菌实验，也证明DNA是遗传物质。这两个实验中主要的论点证据是：生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。（二）现代分子生物学的建立和发展阶段1956年A.Kornbery以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl提出并证明DNA半保留复制模型。1968年Okazaki(冈畸)提出DNA不连续复制模型。1972年证实DNA复制开始需要RNA作为引物。（三）认识并开始改造生命的发展阶段1、重组DNA技术的建立和发展1）分子生物学理论和技术的发展阶段1970年R.Yuan和H.O.Smith发现限制性内切酶1972年Bery等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素2）转基因动植物的成功1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核，得到比原小鼠个体大几倍的”巨鼠“我国将生长激素基因转入鱼受精卵，得到转基因鱼，导入了凝血因子IX基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子IX，能有效地用于血友病治疗。1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿。1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，我国将蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。2、基因诊断与基因治疗在医学领域的发展对遗传疾病的治疗，使变异基因和异常表达的基因变为正常基因，从根本上治愈遗传疾病，这就是基因治疗的基本思想。1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。1994我国用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。3、基因组研究的发展目前分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。1977年Sanger测定了ΦX174全部5375个核苷酸的序列；78年Fiers等测出SV-40全部5224对碱基序列；80年代λ噬菌体48,502硷基对的序列全部测出；96年测出了大肠杆菌4x106碱基对序列；90年人类基因组计划（HumanGenomeProject）开始实施，测定出人基因组全部3x109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因的一级结构。4、单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。80年代以后随着基因工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体等为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。5、细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域Sutherland1957年发现cAMP、1965年提出第二信使学说。1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，将G蛋白与cAMP的作用相联系起来，对G蛋白偶联信号转导途径有了新的认识。随后蛋白酪氨酸激酶途径的发现、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究有了长足的进步。对细胞中的信号转导途径已经形成了基本的概念三、分子生物学的主要研究内容分子生物学主要包含以下三部分研究内容1、结构分子生物学：结构分子生物学是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。他包扩结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。2、基因表达与调控基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译；在个体发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调控），并随着内外环境的变化而不断的加以修正（环境调控）。原核基因的表达调控主要发生在转录水平，真核基因的表达调控可发生在以下三个方面：信号转导、转录因子、RNA剪辑。3、DNA重组技术：是将不同的DNA片段（如基因或基因的一部分）按照人们的设计定向的连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。DNA重组技术也称为基因克隆或者分子克隆，它实际上包括了一系列的实验技术，最终目的是把一个生物体中的遗传信息(DNA)转入另一个生物体。四、分子生物学在农业中的应用改良作物品质：提高蛋白质含量和氨基酸组成；提高植物的抗逆性：抗旱、抗寒、抗病、盐碱。生物农药：生物杀虫剂Bt毒蛋白基因；水果的保鲜：通过反义基因抑制乙烯基因表达；改变花色、花期：对色素基因的改造来改变花的颜色；调控植物激素基因的表达控制花期；转基因动、植物作为生物反应器生产药用蛋白：转基因牛、烟草；转基因猪生产人血红蛋白；转基因羊：澳大利亚、新西兰生产彩色羊毛。五、现代生物技术的社会伦理问题新物种的产生：转基因动植物病毒所带来的未知后果，生物武器等，受到素食者的反对：种族歧视的借口：96年从白种人的基因组中分离出抗HIV（爱滋病）基因，其他人种中迄今没有发现该基因的同源序列。性别检测与克隆人：已有法律约束，但可以利用胚胎干细胞培育人体所需的器官。第二章：染色体与DNA教学目的：1、了解核酸研究的历史2、掌握核酸的组成及其特性3、掌握核酸一级结构及高级结构要点4、掌握核酸测序、Sourthernblotting、RFLP等技术的原理本章重点：1、DNA双螺旋结构模型要点。2、核小体的概念。3、DNA的变性、复性及分子杂交。思考题：1、名词解释：核酸的一级结构、碱基互补规律、回文序列、核酸的变性与复性、Tm值、核酸分子杂交、染色体、染色质、基因、基因组、C值矛盾、转位因子、卫星DNA、增色效应，2、比较DNA和RNA化学性质之异同3、简述DNA双螺旋结构模型的主要依据及基本特点。4、影响变性与复性的因素分别为哪些？5、简述真核生物基因组特点及与原核生物基因组的区别。教学内容：一、基因与基因组基因：一般是指表达一种蛋白质或功能RNA的遗传物质的基本单位。基因组：是指某种生物所包含的全套基因。如：原核生物结构简单只有一个染色体，所有的基因都在这条染色体上，即构成该生物的基因组。随着生物的进化基因组的数值（基因组C值）随之增加，人类的基因组是包含在23对染色体中的所有基因，其单倍体基因组的C值在3x109bp；病毒含103~105bp；细菌含105~107bp。基因与蛋白质：假定平均以1000bp(1kb)编码一个蛋白质，最小的病毒可含4~5个基因；大肠杆菌含3000~4000个基因；而高等生物的染色体则可含有10万个以上基因。按理论计算人类应有200~300万个基因（3x109bp)，实际只有10万个左右，因为含有非编码序列和隔离序列及尚不知功能序列；病毒的基因数要比计算所得的大，因有基因重叠现象。（一）原核基因组原核基因组主要包括病毒基因组和属于原核生物的细菌基因组。1、病毒基因组：病毒（包括噬菌体）DNA分子是最小的，最小的病毒基因组仅有5kb左右，最大的有200kb左右。有些病毒的基因组不够编码自己的蛋白质，如φx174要编码9个蛋白质(至少需要9kb)，而基因组仅有5kb左右，为解决这一矛盾，就出现了基因重叠现象，如A基因和B基因的重叠：2、细菌基因组：细菌基因组含有染色体和染色体外的DNA—质粒。质粒（plasmid）：是独立于染色体之外的双链环状DNA分子，含有遗传信息能进行自主复制，并传至子代细胞，小的质粒仅有几个kb，大的有500kb，每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，用于克隆的载体。1）质粒的特点a.是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的质粒比较容易分离纯化，＞15kb的质粒则不易提取。b.能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomousreplicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。c.每个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制。d.质粒对宿主生存并不是必需的e.细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因。如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐氰霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。细菌的抗药性，常与R质粒在细菌间的传播有关，F质粒能促使这种传递。分子生物学使用的质粒载体是经过了许多的人工的改造。如：pBR322及pUC18。2)细菌基因组的结构特征a.功能上相关的基因串联在一起组成操纵子结构，受同一个启动子调控，几个基因转录在同一条mRNA上，形成多顺反子mRNA。b.基因组中不存在内含子，基因是连续的。不存在不连续基因，转录后无须进行加工修饰，直接可以翻译。c.基因组的大部分是编码区，只有小部分是非翻译区，其中包括调控部分。d.少数基因有基因重叠现象。（二）真核基因组真核基因组结构特征：真核基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，在脊椎动物中90%左右是非编码序列，而且编码序列大多数被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，称为割裂基因，非编码的内含子则存在广泛的序列变异，说明内含子中的大部分序列是无功能的。1、重复序列：在DNA中有一段碱基序列多次重复出现。根据重复出现的次数可分为：高度重复序列、中度重复序列、单拷贝基因。1）高度重复序列：一般由较短的序列组成，常集中在一起，串联排列，重复次数可高达几百万次。将这种高度重复序列常称为卫星DNA。在真核基因组DNA中的G：C碱基对的分布与细菌中不同，是不均一的，由于有这种碱基组分分布的不均一，在CsCl等密度剃度超离心分离后，出现一个主峰和1~2个小峰，这种小峰对主峰而言尤似主峰的卫星，所以称卫星DNA，它是多种短重复序列的混合物，人们按照重复序列的长短将卫星DNA分成3类：a、卫星DNA：重复序列长度在100bp左右，主要存在于异染色体近中心粒和端粒，在人群中多态性不强。b、小卫星DNA：重复序列长度在15~70bp，主要存在于常染色体中，在人群中有高度多态性。c、微卫星DNA：重复序列长度在2~6bp，但串联起来的总长度有高度变化，这种长度的多态性是由于精卵结合在减数分裂过程中发生不相等的交叉重复造成的，使它的长度在每一个个体中就有差别，这是进行DNA指纹分析的基础。2）中度重复序列：这类重复序列的重复次数在10~104bp之间。如各种rRNA、tRNA等基因属于这一类。3）单拷贝基因：基因组中仅出现一次的基因称为单拷贝基因。2、基因割裂现象：单拷贝基因都是编码蛋白质的基因，大多数不连续的，即基因内部含有非编码序列---内含子，和编码部分----外显子，这种割裂基因是真核生物的普遍现象。内含子有一个共同的特征：5/端以GT开始，3/端以AG结束，称为GT/AG规则。3、一个基因编码两种以上的mRNA：在原核生物中，由于相关基因串联在一起构成操纵子，产生多顺反子mRNA，翻译出多种蛋白质。在真核生物中没有操纵子结构，每个基因都单独构成一个转录单位，产生单顺反子mRNA，仅编码一种蛋白质。编码两种以上的mRNA主要是通过拼接方式来完成的。4、基因家族：来自一个祖先基因，通过扩增形成多个结构和功能相关的基因，称为基因家族。所编码的蛋白质是同源的。如：组蛋白基因家族，有5个成员，即HI、H2A、H2B、H3、H4。5、假基因：来源同一个祖先基因但不具有转录功能，不能产生有功能的mRNA。而这些尚失功能的扩增基因仍留在基因家族中，这种基因称为~。不具内含子，推测可能来源于cDNA。6、限制性片段长度多态性：（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）DNA顺序发生了突变，使突变所在部位的某种限制性内切酶的位点发生改变。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA时，便会产生与正常不同的限制性片段。这样，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型。二、核小体与染色体核小体：DNA双螺旋链,等距离缠绕组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各二分子组成八聚体形成众多核心颗粒,外绕1.75圈左走向的DNA链,每圈约85bpDNA,各颗粒之间为带有H1组蛋白的连接区DNA。1、组蛋白特征进化上极端保守性：不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的。无组织特异性：仅有鸟类、鱼类、两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5。钛链上氨基酸分布的不均匀性：碱性氨基酸集中分布在N端，而大部分疏水基团分布在C端。组蛋白的修饰作用包括：甲基化、乙酰化、磷酸化，富含赖氨酸和精氨酸：H5还富含丙氨酸、丝氨酸。2、非组蛋白HMG蛋白（HighMobilityGroupProtein)：分子量小3x104以下电泳迁移快而得名，易用低盐溶液0.35mol抽提，其功能可能与DNA的超螺旋结构有关。DNA结合蛋白：是一些与DNA复制或转录有关的酶或调节物质，需用2molNaCl和5mol尿素才能解离。三、DNA的结构1、一级结构1953年Watson和Crick创立的DNA双螺旋结构模型，阐明了DNA分子的结构特征，提出DNA是遗传分子。DNA的一级结构：是指4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了DNA分子的化学构成。四种脱氧核糖核苷酸分别表示为：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP。DNA分子是由这四种不同的脱氧核苷酸，通过3，5-磷酸二酯键连接而成的直链分子。DNA分子的多样性：组成DNA分子的碱基虽然只有四种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，而构成了DNA分子的多样性。如：某一DNA分子是由100个bp组成，它们的可能排列方式就是4100。实际上DNA链中的碱基数远远超出100个，所以，它们的排列方式几乎是无限的。即生物的多样性。因此，DNA中的碱基排列顺序是DNA分子的重要属性。对一种DNA属性的最基本了解就是测定其碱基的排列顺序一级结构。DNA一级结构的测定：双脱氧末端终止法——Sanger法：原理是采用核苷酸链终止剂—2ˊ,3ˊ--双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ—ddNTP）终止DNA的延长。由于它缺少形成3ˊ,5ˊ--磷酸二脂键所需要的3ˊ-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段DNA序列分析。方法：在A,C,G,T四种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应后，生成具有相同的5末端，而3ˊ端不同的DNA片段混合物，经电泳分析后可以从放射自显影上读出DNA序列。2、DNA的二级结构Watson和Crick于1953年根据DNA纤维X射线晶体衍射图及其它试验资料，提出了DNA为右手双螺旋结构的科学假设，随后证明他们提出的DNA构象是DNA分子最为常见的结构，通常称为B型DNA。而DNA分子的结构不是固定不变的，在不同的环境因素，都可促使DNA分子形成不同的构象。通常情况下可分为两大类：一类是右手螺旋，如、B-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、A-DNA；另一类是局部的左手螺旋，即Z-DNA。B-DNA、A-DNA、Z-DNA的主要区别：(1)A-DNA更紧密，每个碱基平面距离为0.256nm，每圈螺旋有11对碱基，螺距为2.8nm；B-DNA碱基距离为0.338nm，每圈螺旋有10对碱基，螺距为3.4nm。(2)C和G之间核苷酸中脱氧核糖的折叠不同，A-DNA是C3’在内，B-DNA是C2’在内。(3)B-DNA大沟、小沟的深度基本是一致的，只是大沟较宽；A-DNA大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。(4)Z-DNA糖-磷酸主链的走向呈“之”字形，分子呈左手螺旋构象。(5)Z-DNA较B-DNA细而舒展，螺旋直径为1.8nm，每个碱基平面距离是0.37nm，每圈含12对碱基，螺距为4.5nm。(6)Z-DNA是C3’在内与A-DNA相同。(7)Z-DNA仅有一条小沟，且较深，含有较高的负电荷密度。Z－DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。3、DNA的高级结构DNA三股螺旋结构概念是在1957年提出来得，至1987年在质粒的酸性溶液中发现了分子内的三股螺旋DNA，将此种构型的DNA称为H-DNA。它是双螺旋DNA分子中一条链的某一节段，通过链的折叠与同一分子中DNA嘌呤嘧啶双螺旋（其中一条链只有嘌呤AG，另一条链只有嘧啶CT）节段结合而形成的。DNA形成一种分子间的三股螺旋DNA，从而可在转录水平上阻止基因的转录。这就是反基因策略，或称反基因技术。超螺旋结构是DNA分子高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两类，一般DNA双螺旋结构中每圈是10个bp，大于或小于10会出现正或负超螺旋结构，环状DNA分子常以超螺旋结构存在，并以负超螺旋为主，有利于转录的起始。四、DNA结构的不均一性反向重复序列(invertedrepeats)又称回文序列(palindrome)，它能在DNA或RNA中形成发夹结构。这种回文结构通常是作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶及调节蛋白的识别位点，转录终止信号等。富含A/T的序列：在很多有重要调节功能的DNA区段都富含A-T特别是在复制起点和启动子的Pribnow框(真核生物为TATA框)的序列中，其对于复制和起始十分重要。因为A－T对只有二条氢键，此处的双链较G－C对处易于解开，有利于起始复合物的形成。五、DNA的变性、复性和分子杂交1、DNA的变性（denaturation）：在加热、碱性等条件下，A-T,G-C氢键断裂，形成单链结构。DNA在溶液中发生变性伴随着一系列理、化性质的改变。紫外吸收强度增加；溶液粘度降低；沉降速度增加等。紫外吸收强度的增加与变性（解链）程度成正比；DNA的热变性常称为DNA的“融解”，解链曲线的中点所示的温度称为Tm或称为融点，Tm表示使50%DNA分子解链的温度。不同种类DNA有不同的解链曲线，也有不同的Tm，Tm随（G+C）%含量呈线性增加。2、DNA的复性：去除变性条件后，DNA可以回复成双链结构，恢复原有的物理化学特征和生物学活性，称为DNA复性（renaturation）。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。3、核酸的分子杂交：用放射性同位素或荧光素及其他物质标记的已知核酸片段或寡聚核苷酸作为探针，借助探针探测分析未知的核酸样品。称为Southern印迹分析。Northern印迹分析：根据Southern的原理，用已知DNA作探针，分析检测RNA的方法。菌落或噬菌斑原位杂交：将硝酸纤维素膜置于布满细菌菌落或噬菌斑的平板上，使平板上每一菌落的一些细菌或噬菌斑的一些DNA粘到硝酸纤维素膜上，形成平板的一个复制品，然后用碱处理，让细菌裂解，DNA变性，就在原位固定于硝酸纤维素膜上，再进行分子杂交。六、DNA复制的方式及一般过程：(一)DNA的半保留复制(semiconservativereplication)Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的实验依据：1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有15N标记的培养基中培养得到15NDNA。然后将15NDNA细菌转移到含有14N标记的培养基中进行培养在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心观察DNA所处的位置（见图3-4、3-5）由于15NDNA的密度比14NDNA的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。半保留复制的实验结果：在全部由15N标记的培养基中得到的15NDNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15NDNA和14N-DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N-DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱。半保留复制进一步的实验证椐：为证实第一代杂交分子确实是一半15NDNA一半14NDNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15NDNA)及低密度带(14NDNA)。它们的实验只有用半保留复制理论才能得到圆满的解释。（二）DNA复制的一般过程：DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形成一个复制叉或复制泡，两条单链分别做模板，各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是5′→3′方向，另一条链的走向是3′→5′方向，但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链(leadingstrand)，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的。而另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随从链(laggingstrand)，随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段(Okazakifragments)，原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制。DNA复制过程的三个阶段第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成。第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。第三阶段为DNA复制的终止阶段。（一）DNA复制的起始阶段：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originofreplication)。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中只有一个复制起始点，即有一个复制子。在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有许多个复制子。1、DNA复制起始点的结构特性：大肠杆菌复制起始点Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。有些生物复制起始点Ori是富含A?T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。2、DNA复制的方向性：(1)定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡；(2)定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉(replicationfork)。(3)两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。3、DNA复制的起始：DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的。DNA解链酶：能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）：能保证解开的双链保持单链结构，但不起解链作用。RNA聚合酶：合成RNA引物，再由DNA聚合酶合成新的DNA链。（二）DNA链的延长DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它们在DNA复制中的作用。1、DNA聚合酶：1957年，Arthurkornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNApolymeraseⅠ,简写DNApolⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNApolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。DNA聚合酶的共同性质：①需要DNA模板；②需要RNA做为引物；③催化dNTP加到引物的3′-OH末端，因而DNA合成的方向是5′→3′；④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。DNA聚合酶Ⅰ和II主要起到修复DNA和复制的准确性中发挥作用；DNA聚合酶III是DNA复制链延长反应中的主导聚合酶。真核生物DNA聚合酶：真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。复制中起主要作用的是DNApolα。DNApolβ与DNA修复有关。DNApolγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNApolδ前导链的合成靠DNApolδ催化，并且还需要一种细胞周期调节因子（proliferatingcellnucleusantigen,PCNA)参与而随从链的合成靠DNApolα和引发酶配合作用完成。2、与超螺旋松驰有关的酶：拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。（三）DNA复制的终止阶段DNA合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由许多相邻的片段，在连接酶的催化下，以3′、5′－磷酸二酯键相连接成为一条长链。连接反应中的能量来自ATP(或NAD＋)。大肠杆菌染色体DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制。真核与原核生物DNA复制的特点：真核生物DNA复制有许多起始点，原核生物只有一个，真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始，而原核生物复制起始点上可以连续开始新的DNA复制。真核生物DNA聚合酶主要以α、β、γ三种酶为主，α是关键酶，一般不具有外切酶活性。真核生物线性DNA末端具有端粒结构。端粒的结构：是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，一般由多个串联在一起的短寡核苷酸（5-8bp）序列组成。人的端粒DNA约5-15kb。端粒的功能：保证线性DNA的完整复制；保护染色体末端不受核酸酶水解和不发生染色体的异常重组；决定细胞的寿命，体细胞端粒酶活性低。随着复制次数的增加端粒DNA逐步缩短，细胞逐渐停止分裂，而进入凋亡。恶性肿瘤细胞可表达端粒酶，永生分裂。端粒DNA的合成：真核生物体内都存在一种特殊的反转录酶叫做端粒酶(telomerase)。它是由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′OH末端延长DNA。再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链形成端粒结构三、反转录作用(reversetranscription)，1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为模板合成DNA称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reversetranscriptase)。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。1、反转录酶的催化作用：反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′OH末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。2、反转录酶的特点：①RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，RNA为引物（多为色氨酸tRNA）催化dNTP聚合。不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH（水解酶）活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以cDNA为模板以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。此外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。3、反转录酶发现的意义：反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNAlibrary)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。六、基因突变和基因的损伤与修复1、基因突变的分类：a、点突变：DNA分子中单个碱基的改变，一种碱基被另一种碱基取代。同类碱基之间取代，称转换；否则称颠换。b、碱基的插入突变：在DNA的某一位点插入一个或一个以上的碱基。c、碱基丢失突变：在DNA的某一位点缺失一个或一个以上的碱基。2、突变可能造成的后果：a、突变可能使生物更有利于适应环境，引起生物进化。b、导致生物体的死亡，属致死突变。c、引起结构、形态和功能的异常，产生先天性疾病。d、引起细胞的癌变，癌基因和抑癌基因的突变是许多肿瘤发生的原因。e、不发生任何变化和影响。3、基因突变的特征：a、突变以一定的概率随机发生。b、突变有可逆性。c、突变的发生频率可被外界因素（化学、物理、生物等）所加强。d、突变是可以遗传的。4、基因的损伤:基因损伤具有比基因突变范围更广的概念，一切使DNA结构和功能发生改变的DNA变化，都可称为基因的损伤。突变也是DNA损伤的一种，除以上的突变类型外，还包括：a、碱基损伤。b、DNA链断裂，有单链断裂和双列断裂。引起基因损伤的因素：1）物理因素：a、紫外线：紫外线照射可能引起DNA连上两个相邻的胸腺嘧啶发生聚合反应，形成胸腺嘧啶二聚体，阻止DNA的复制和转录。b、电离辐射：X、α、β、γ射线引起DNA的损伤。包括DNA的主链断裂，一条或两条的断裂，碱基聚合，糖苷链的断裂等，引起大片段损伤或丢失，造成染色体畸变、基因突变、细胞死亡等。2）化学因素a、烷化剂：烷化剂可与DNA碱基（或糖基上的羟基）发生烷基化反应，生成烷基化碱基。可引起配对错误，发生突变。b、核苷酸类似物：如5-溴尿嘧啶，是胸腺嘧啶的类似物，在DNA复制时取代胸腺嘧啶进入DNA。5-溴尿嘧啶在体内，以烯醇式存在，再次复制时，与G配对，引起碱基置换突变。c、代谢产生的活性物质：有两类代谢产生的活性物质，以是从外界进入人体的化合物，本身没有活性，经体内的代谢反应后，产生具有很强反应性的代谢产物，例如苯并芘、黄曲霉毒素等。3）生物因素DNA病毒和RNA病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等都可能使DNA发生改变，引起基因突变。4）自发损伤或突变生物体不接触任何致突变剂，也可能自发的发生基因突变。包括：DNA复制时的碱基错误配对；碱基的互变异构；脱氨基。5、基因修复1）直接修复：a、光修复：是一种酶促反应过程，通过光修复酶，可以