布病的实验室诊断

布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)病概况布鲁氏菌病（以下简称布病）是一种全球分布的由布氏菌引起的人兽共患传染病。布氏菌通过(tōngguò)皮肤粘膜、消化道、呼吸道等途径浸润人体而出现发热、关节痛、乏力、多汗为主的临床症状，可以造成骨关节、免疫、消化、循环、神经等多系统损害，其临床表现复杂多变，无特异性。

共六十四页全球(quánqiú)布鲁氏菌病疫情2013年上半年世界(shìjiè)羊布鲁氏菌病分布图（引自OIE）ICDC,ChinaCDC共六十四页3共六十四页4共六十四页5共六十四页Amsterdam,TheNetherlandswww.kit.nl世界卫生组织建议(jiànyì)的人布鲁氏菌病诊断世卫组织建议的检测包括：虎红平板试验(RBT)血清(xuèqīng)凝集试验(SAT)Coomb`s试验补体结合试验(CFT)ELISA荧光偏振布氏菌培养PCR世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏性和特异性）没有明确的阳性和阴性预测值（PPV&NPV）结论取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不同，有待优化PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立建议开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵敏性、特异性、PPV和NPV等）共六十四页WHO人布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)病的诊断检测IgM/IgG侧向层析检测(jiǎncè)荧光偏振检测虎红平板试验血清凝集试验2-ME试验IgM/IgGELISA库姆斯(IgG)CFT培养

（仅在BSL-3中）PCR简易/快捷复杂/要求高灵敏性+++++++++++++++参考+++++++++++特异性++++++++++++++++++++参考++++++++保健点参比实验室诊断机构共六十四页布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)病病原学布鲁氏菌为革兰阴性短小杆菌，0.5-0.7×0.6-1.5nm，初次分离时多呈球杆状和卵圆形，故称“布鲁氏菌”。菌体无鞭毛，不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的荚膜。1985年WHO布鲁氏菌病专家季员会把布氏菌属分为6个种19个生物型。羊种（1～3型）、牛种（1～9型）、猪种（1～5型）及绵羊型副睾种、沙林鼠种、犬种各1个生物型。中国已分离到14个生物型，即羊种（1～3型），牛种（除5型以外的7个型），猪种（1.3型），绵羊副睾种和犬种各1个型。临床上以羊、牛、猪三个种意义最大，羊种致病力最强。多种生物型的产生(chǎnshēng)可能与病原菌为适应不同宿主而发生遗传变异有关。共六十四页布氏菌可被碱性(jiǎnxìnɡ)染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢布氏菌革兰染色(rǎnsè)共六十四页共六十四页布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)的分离培养1、血培养：1）双相培养基：血液10mL注入双相培养基中→37℃温箱培养→每48小时观察→无细菌生长继续培养→培养至30日才发出报告。2）自动化培养：血培养瓶置全自动血培养仪中→有菌生长仪器(yíqì)报警→做鉴定2、骨髓培养：按临床骨髓穿刺法抽取骨髓，按照血液培养方法培养。共六十四页自动(zìdòng)培养仪和培养瓶共六十四页疑似布鲁氏菌时：抽取菌液少许，接种到血琼脂培养基中，进行纯培养。要求一定(yīdìng)生物安全柜内操作！生化反应进一步鉴定：

自动化设备布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)培养与鉴定共六十四页培养(péiyǎng)特性专性需氧，生长缓慢生长温度20-40℃，最佳生长温度35-37℃，pH6.6-7.4，马耳他布鲁氏菌和某些牛种菌需要(xūyào)较严格的5%-10%CO2。布鲁菌属对营养要求较高，生长中需要各种氨基酸、离子、烟酸和生物素，有点菌种需要血清或全血才能生长共六十四页布氏琼脂(qióngzhī)布鲁氏菌菌落血平皿布氏菌菌落(jūnluò)布鲁氏菌培养与鉴定共六十四页研究(yánjiū)方法VITEK2全自动微生物生化(shēnɡhuà)分析仪共六十四页布氏菌生化(shēnɡhuà)鉴定共六十四页借助VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统建立了一套布鲁氏菌的生化鉴定参考标准分型方法。完善布鲁氏菌生化鉴定数据库。鉴定布鲁氏菌速度快，可靠性高，确定布鲁氏菌属的鉴定指标为L-脯氨酸芳胺酶（ProA）、酪氨酸芳胺酶（TyrA）、尿素酶（URE）、氨基(ānjī)乙酸芳胺酶（GlyA）；区分羊种布氏菌的指标为ELLMAN（ELLM）；区分牛种布氏菌的指标为乳酸盐产碱（1LATK）；区分猪种布氏菌指标为丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶（APPA）.当鉴定为人苍白杆菌时，需与布鲁氏菌进行鉴别。全自动微生物生化鉴定(jiàndìng)结果共六十四页

羊种菌为人主要(zhǔyào)致病菌种生物型H2S染料抑菌血清凝集噬菌体裂解硫堇复红AMRTbWbBK2羊1-++-+---+2-+++----+3-++++---+病原(bìngyuán)特征共六十四页羊1型为主羊3型为主19631969-19712005病原(bìngyuán)特征羊种菌菌型变迁(biànqiān)共六十四页冻干机设备(shèbèi)共六十四页菌种保存(bǎocún)管共六十四页BCSP31-PCR引物和扩增片段，产物223bpPrimer1：B45’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’Primer2：B55’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’检测BCSP31基因的PCR方法，可以在属的水平(shuǐpíng)上检测和鉴定布鲁氏菌菌株OIE推荐鉴定布鲁氏菌种的方法之一

共六十四页MDL2000DNALadder

1。B.melitensis2.B.abortus3.B.suis4.B.ovis5.B.neotomae6.B.canis

M123456布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)属BCSP31-PCR电泳结果

-----223bp共六十四页AMOS-PCR鉴定(jiàndìng)布氏菌种布鲁氏菌DNA多态性一个原因就是插入序列分布，IS711就是一段插入序列，在数量和位置上都很保守，一个引物锚定在IS711上，其他不同的引物分别选在与插入基因IS711邻近的单染色体DNA上，代表种的特异性，通过扩增带的大小来鉴别种。设计5条引物的混合反应体系，适用于布鲁氏菌种间的鉴定方法(fāngfǎ)，可鉴别布氏菌牛种1，2，4型、羊种布鲁氏菌、猪种1型和绵羊附睾种。除了共有的178bp以外牛种布鲁氏菌1，2，4型扩增条带为498bp，羊种布鲁氏菌扩增片段为731bp，猪种1型扩增条带为285bp，绵羊附睾种961bp。共六十四页

19株标准(biāozhǔn)菌株AMOS-PCR扩增结果

1000bp

123456789101112131415161718

192021222000bp750bp500bp250bp200bp

1、22.DL2000DNALadder2-4.B.Melitensis1-35-11.B.Abortus1-712.B.Abortus913-17.B.Suis.1-518.B.ovis19.B.neotomae20.B.canis21.阴性(yīnxìng)对照共六十四页750bp500bp250bp

M1234567891011250bp

223bp

布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)属种鉴定1-5AMOS扩增1、c-2、羊13、牛14、猪15、待检菌株

6-10BCSP31-PCR：6、羊17、牛1

8、猪1

9、OVIS10、待检菌株共六十四页多重PCR(Bruceladder)EvaluationofaMultiplexPCRAssay(Bruce-ladder)forMolecularTypingofAllBrucellaSpecies,IncludingtheVaccineStrains共六十四页B.abortusB.melitensisB.suisB.cains布氏菌

MLVA分型共六十四页中国分离(fēnlí)株的基因型分布省份主ST型菌株数主ST型菌数主ST型比例内蒙古8722636.1%四川811654.5%新疆811545.5%宁夏810660.0%广西217228.6%河南87342.9%山东87571.4%辽宁325240.0%青海85480.0%上海85240.0%安徽40.0%甘肃294250.0%广东84250.0%吉林84375.0%共六十四页布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)血清学检测常用方法有：虎红平板(píngbǎn)凝集试验试管凝集试验（莱特试验）半胱氨酸试管凝集试验抗人球蛋白试验共六十四页Amsterdam,TheNetherlandswww.kit.nl虎红平板(píngbǎn)试验Rose-BengalPlateAgglutinationTest检测特征(tèzhēng)（流行率低）灵敏度92.9（急性病例）特异性94.3%（无暴露史）

特异性91.7%（重复暴露）

特异性76.9（既往布病患者）

Ruis-MezaetalClinMicrobiolInfect.2005;11(3):221-5不同来源（品牌）和批次的抗原质量差异很大难以解读（弱阳性）由于暴露和非特异性反应，在疾病流行地区的表现不良需要确定取舍值结论诊断功效在很大程度上取决于制剂来源和疾病流行程度，需要确定取舍值共六十四页虎红平板(píngbǎn)凝集试验它是一种半定量的凝集反应试验。所用抗原是用虎红(四氯四碘荧光素)色素(sèsù)染成的一种酸性抗原，具有克服非特异性反应，对检查小分子抗体IgG较为敏感的特点。虎红平板凝集试验(RBPT)方法:在清洁的玻片上加0.03ml的受检血清，然后再加入上述标化抗原悬液0.03ml，使充分混匀，在4分钟内观察结果，以出现可见的凝集反应为阳性。共六十四页虎红玻片凝集(níngjí)试验（RBT）筛查试验(shìyàn):简便、实用、快速、经济，适用于基层单位检验

共六十四页全血玻片凝集反应在一张清洁的破片上加1滴赫德逊氏反应抗原，然后在抗原上加1滴受检血液或关节腔内积液，可用加样器吸头使其混匀，在酒精灯上稍微加热，促进反应，在8分钟内观察结果，凡在此时间内出现凝集者为阳性。也可以(kěyǐ)加入0.08-0.01ml不同的血液量，再加入1滴抗原，粗测血标本效价。共六十四页玻片凝集(níngjí)的评价虎红平板凝集试验和全血玻片凝集试验为初筛、定性凝集试验或半定性凝集试验，优点是较试管凝集试验操作更简便，检测迅速，尤其是虎红平板凝集试验是在酸化抗原基础上制备的带有色素的抗原制剂，经大量的研究资料证明，本法与常规血清学试验有较高的符合率，是人畜布氏菌防治工作中，广泛(guǎngfàn)采用的一种筛选试验方法。但此两种平板试验，尤其是全血玻片凝集试验，可能出现非特异性凝集反应，在单以平板凝集反应诊断布氏菌病时，应考虑到此点，以免误诊。对阳性和疑似标本必须进行SAT确证，才能作为实验结果。共六十四页RBT注意事项抗原(kàngyuán)质量被检血样反应板结果观察和判定记录报告诊断价值与意义与其它实验的关系

共六十四页试管(shìguǎn)凝集(莱特试验)原理在已知的特异性抗原—布氏菌抗原的悬液中加入未知的被检患者血清，若患者血清中含有(hányǒu)布氏菌抗体，抗原与抗体发生肉眼可见的凝集反应。共六十四页可作为布氏菌病早期诊断(zhěnduàn)方法，病人常于发烧的第1天起就开始出现凝集素，而且出现高滴度凝集素或凝集素滴度不断上升，不仅有很高的诊断意义，同时也可作为判定疾病活动性指标。目前，虽然出现了不少新的诊断布氏菌病的技术方法，但仍不能取代本试验方法，而这些新方法则是对本法的补充和完善。共六十四页但是，作为单一的诊断方法是不完善的。从国内外的研究资料表明，仅用凝集反应对畜群进行多次检查(jiǎnchá)，仍有许多布氏菌病病畜检查(jiǎnchá)不出来；对部分慢性期布氏菌病患者得不出阳性反应结果；还有一些其他疾病患者，在血清学上与布氏菌病存在交叉凝集反应，因而做本试验是难于排除的。因而有必要做多种血清学实验检查(jiǎnchá)，以便综合性判定，获得正确结果。除每份待捡血清需作1个血清对照，以排除血清的自然凝集外，每次试验尚需有1个抗原对照，以排除所用抗原的自然凝集。共六十四页试管凝集(níngjí)(莱特试验)0.5ml抗原(kàngyuán)试管凝集反应操作示意图0.2ml血清2.3ml盐水0.5ml盐水0.5ml弃去0.50.50.50.50.50.50.5共六十四页试管(shìguǎn)凝集(莱特试验)结果判定：效价以产生50%凝集（++凝集程度(chéngdù)）血清最高稀释倍数为受检血清效价共六十四页试管(shìguǎn)凝集(莱特试验)试管凝集试验标准(biāozhǔn)比浊管配制共六十四页试管(shìguǎn)凝集(莱特试验)诊断标准：1、人、牛、马、鹿等大家畜血清(xuèqīng)为1：100（++）及以上者为阳性，1:50（++）为可疑。2、对可疑反应的人或动物应在10-25天内重复检查，以便进一步确诊共六十四页方法与临床：1、该法特异性较好，敏感性较高，适用于检疫和临床诊断

2、由于该方法有时出现(chūxiàn)前带现象和封闭现象，所以有时出现(chūxiàn)阴性结果，必要时和其他方法联合应用试管凝集(níngjí)(莱特试验)共六十四页试管凝集(níngjí)检测StandardTubeAgglutinationTest发病后不同月份的灵敏度(%)0-22-44-6>6SAT(1:100)79.564.476.950.61:501:1001:2001:4001:8001:1600发现凝集抗体（IgM和IgG)灵敏性随疾病持续时间下降顽固性和布病复发患者中表现不佳在本地流行地区/暴露个体中的特异性较低流行地区的建议取舍值为1：200，提高(tígāo)特异性导致的低灵敏度难以读取和标准化共六十四页SAT注意事项抗原稀释液定量对照温度结果(jiēguǒ)判定记录报告单共六十四页当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播(chuánbō)途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行。生物安全(ānquán)的评估共六十四页共六十四页注：a大量活菌操作：实验操作涉及“大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、冻干等）。c样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸(hésuān)提取、涂片、显微观察等初步检测活动。d非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。共六十四页布鲁氏菌感染(gǎnrǎn)途径感染途径：吸入、皮肤粘膜污染、摄入等吸入感染：很多操作可产生气溶胶，如：感染动物的皮毛、粪便，烧接种环、抽真空、离心、搅拌、研磨等，气溶胶≤5um液滴核会悬浮于空中皮肤粘膜污染：含病原体的液体(yètǐ)溅在眼睛、口鼻粘膜及其他皮肤感染摄入感染：误食和不洗手吃食物接种感染：共六十四页感染(gǎnrǎn)事件共六十四页感染(gǎnrǎn)事件造成此次事故的原因：一是购买实验山羊时，相关教师未要求青喜养殖场出具相关检疫合格证明；二是实验前相关教师未对实验山羊进行现场检疫；三是在指导学生实验过程中，相关教师未能严格要求学生遵守操作规程(cāozuòguīchéng)、进行有效防护。共六十四页存在(cúnzài)的问题职责不履行，不开展检测培训不到位，未开展监督与指导操作不规范，未严格执行操作规程防护不落实，未严格执行生物安全规定

存在潜在感染(gǎnrǎn)的风险！！！共六十四页

1、布鲁氏菌强毒菌株、疫苗菌株、弱毒菌株均可能造成人体感染，感染所需菌量会有较大差别。2、实验活动(huódòng)与实验室级别要求布病血清学实验可以在BSL-1实验室进行未知标本分离菌、少量菌株实验、弱毒菌株的实验在BSL-2实验室进行布氏菌的抗原制备、菌种保存在BSL-3实验室生物(shēngwù)安全要求共六十四页布鲁氏菌病血清学实验的生物(shēngwù)安全1生物安全规定BSL-12实验(shíyàn)的分类灭活与否3使用的标本血清全血血浆脑脊液4血清中的布氏菌未分离到其它病原？5血清中的核酸难以测到

《人间传染的病原微生物名录》ICDC,ChinaCDC共六十四页布鲁氏菌(bùlǔshìjūn)病病原学实验生物安全布氏菌在病原微生物的危害等级划分；二类属于高致病性实验室适用等级分类：BSL-3其中(qízhōng)弱毒株或疫苗株可在BSL-2实验室操作小量标本，初代分离等在BSL-2实验室操作ICDC,ChinaCDC共六十四页生物(shēngwù)安全设备生物安全柜吸附垫：在操作台上放上贴有吸附材料的塑料薄膜，每日更换，可以(kěyǐ)把操作台的污染减少到最低程度。柜内实验器材和材料的取出

：生物安全实验室的废弃的污染性材料、使用过的包装材料、容器、纸张等废弃物，都收装好或者经高压灭菌器灭菌后拿到缓冲区：实验中或完毕后，必须从安全柜中取出非灭活的病原体时，应装好放在消毒液槽中，使容器外侧被消毒后取出，消毒液种类因病原体不同而异。

共六十四页生物(shēngwù)安全设备回收容器

：在安全柜内配置回收污染物质的容器：配置存放(cúnfàng)污染的玻璃器皿和废弃物容器。容器中必须配有消毒液，将污染物质完全浸没。这些回收容器至少每天操作完毕后盖