IPSC来源肝前体细胞制备及质量鉴定规范

ICS07.080

CCSC04

团体标准

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC来源肝前体细胞制备及质量鉴定规范

SpecificationforpreparationandqualityidentificationofIPSCderivedliver

precursorcells

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国国际经济技术合作促进会发布

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC来源肝前体细胞制备及质量鉴定规范

1范围

本文件规定了IPSC来源肝前体细胞的术语和定义、基本要求、制备过程、质量鉴定。

本文件适用于IPSC来源肝前体细胞的制备与质量鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB3095环境空气质量标准

GB19489实验室生物安全通用要求

GB50073洁净厂房设计规范

GB50346生物安全实验室建筑技术规范

GB50591洁净室施工及验收规范

3术语和定义、缩略语

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

诱导多能干细胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人体细胞经重编程而获得的具有自我更新能力和向三胚层细胞分化潜能的一种干细胞。

3.1.2

冻存cryopreservation

经过程序降温冷冻，并利用深低温冷冻储存技术，以减少细胞代谢活动，保存细胞生物学活性。

3.1.3

复苏thawing

细胞从脱离生长状态重新获得生长活力的过程。

3.1.4

细胞活率cellviability

能够增值、保持正常代谢活性的细胞占全部细胞的百分比。

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：诱导多能干细胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

场地与设施

1

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4.1.1IPSC来源肝前体细胞制备机构选址应符合《药品生产质量管理规范》要求，空气质量标准应符

合GB3095标准分级二级标准。

4.1.2IPSC来源肝前体细胞制备机构实验室或厂房应由具有洁净实验室设计建设资质的工程公司设

计与建造，并应符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的规定。建设完成后，各功能区域的

洁净级别应由专业机构进行检测并出具合格证明。

4.1.3干细胞制备功能区应按IPSC来源肝前体细胞制备工艺进行各区域设计，符合《药品生产质量管

理规范》和《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》要求。干细胞制备机构应配备独立质量检测

实验室，并符合GB19489和GB50346的规定。

设备和耗材

4.2.1IPSC来源肝前体细胞的制备机构应优先选用符合《药品生产质量管理规范》和《干细胞制剂质

量控制及临床前研究指导原则》要求，获得国家资质认证的设备、仪器、耗材和试剂。

4.2.2IPSC来源肝前体细胞的制备机构应对设备、仪器、耗材和试剂供应商进行资质审核认证，要求

供应商提供产品质量报告和批次检验报告，并对耗材及试剂进行质量抽检，避免采购质量不合格的产品。

4.2.3IPSC来源肝前体细胞的制备机构设备和仪器正式使用前应做安装确认(IQ)、运行确认（OQ）和

性能确认(PQ)，并定期进行第三方校准，不得使用有安全隐患的仪器操作样本及细胞制品。

4.2.4IPSC来源肝前体细胞的制备机构应对设备与仪器进行编号建档，并建立标准操作流程(SOP)，

确保使用、运行、保养、维修记录完整可追溯，对于关键工艺相关设备参数应进行实时监测，及时对状

态异常的设备进行校对和维修。

人员管理

4.3.1IPSC来源肝前体细胞制备机构应分别设立干细胞制备负责人、质量管理负责人和质量授权人岗

位。由法人授权任命，任职资质应符合《药品生产质量管理规范》和《干细胞制剂质量控制及临床前研

究指导原则》要求，定期接受岗位专业培训，制备技术负责人与质量管理负责人、质量授权人不得相互

兼任。

4.3.2IPSC来源肝前体细胞制备和质控技术人员应具备的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗

体检测应为阴性，并且(矫正)视力正常，无色盲、色弱。

4.3.3IPSC来源肝前体细胞制备和质控技术人员应半年接受体检一次，有呼吸道感染或发热等疾病状

态下不得进入洁净操作区，需完全康复后方可恢复岗位操作。

4.3.4IPSC来源肝前体细胞制备和质控技术人员上岗前应经过专业培训，内容包括但不限于干细胞理

论与实践、生命伦理、干细胞法律法规、GMP管理、GCP资质、制剂基本知识、细胞培养基础、生物安

全、仪器设备使用与维护方法、物料管理与清洁卫生、岗位职责、操作规范等内容。

5制备过程

样本采集

5.1.1选择适当的成年肝细胞来源作为起始材料制备IPSC来源肝前体细胞。

5.1.2样本的采集应在指定的取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构进行。

5.1.3样本采集应符合医学伦理的相关要求，获取其供者或法定代表人、监护人的同意和授权，并签

署知情同意书。

5.1.4应建立合适的供者筛选标准，至少应包括既往病史和家族病史的调查、传染性疾病的结果、近

期旅行或居住史调查和当前健康状况报告。供者筛选宜参考GB18467相关要求。

5.1.5样本采集过程应采取措施保护供者的健康和安全，并通过无菌技术最大限度降低污染、感染和

病原传播的风险。采集用的接触采集物的试剂和物料应无菌、符合临床安全标准，且在有效期内使用。

细胞培养

5.2.1细胞培养基的选择

2

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5.2.1.1细胞培养基的成分：细胞培养基的成分应包括适当的营养物质、生长因子、抗生素和其他必

要的添加剂，以支持细胞的健康生长。

5.2.1.2细胞培养基的pH值和温度：细胞培养基的pH值应在适宜的范围内维持，并且培养温度应符

合细胞来源的要求。

5.2.1.3培养基的质量控制：应定期检测和确保细胞培养基的质量，包括检查细胞培养基的污染情况。

5.2.2细胞培养条件

5.2.2.1培养皿：选择适当类型和规格的培养皿，以支持细胞的黏附和生长。

5.2.2.2培养环境：维持适当的细胞培养环境，包括CO2浓度、湿度和氧气浓度等。

5.2.2.3培养时间和传代：定期更换培养基，并根据需要进行细胞传代，以避免过度密度和细胞老化。

5.2.3细胞培养的记录和文档

5.2.3.1细胞培养记录：详细记录每次细胞培养的信息，包括培养开始日期、细胞数量、培养基成分、

传代信息等。

5.2.3.2细胞培养文档：建立细胞培养的文档记录，包括培养基配方、培养条件和培养方法的详细描

述。

5.2.3.3细胞培养的质量控制：进行定期的细胞培养质量控制，包括细胞健康状态的评估、细胞的鉴

定和细胞培养的污染。

诱导因子选择

5.3.1诱导因子的种类和特性

5.3.1.1多能性诱导因子：选择适当的多能性诱导因子，如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等，以确保细

胞能够重编程为多能性干细胞。

5.3.1.2肝细胞分化诱导因子：在肝前体细胞诱导过程中，选择适当的肝细胞分化诱导因子，如HNF4

α、FOXA2、ALB等，以促进肝前体细胞向肝细胞的定向分化。

5.3.1.3诱导因子的浓度和添加时间：确定适宜的诱导因子浓度和添加时间，以最大程度地促进细胞

的转化和分化，同时避免不必要的细胞应激。

5.3.2诱导因子的来源和纯度

5.3.2.1诱导因子的来源：使用高质量、来源可追溯的诱导因子，确保诱导因子不带有潜在的细胞污

染或其他不良成分。

5.3.2.2诱导因子的纯度：诱导因子应具有高纯度，以减少不纯物对细胞诱导和分化过程的干扰。

5.3.3诱导因子的质量控制

5.3.3.1诱导因子的活性检测：定期检测诱导因子的活性，以确保其在细胞诱导过程中的有效性。

5.3.3.2诱导因子的质量控制记录：建立诱导因子的质量控制记录，包括批次信息、活性检测结果和

使用情况。

细胞传代

5.4.1传代条件的确定

5.4.1.1传代时间间隔：确定适宜的细胞传代时间间隔，以维持细胞的健康状态并避免过度密度。

5.4.1.2传代液的配制：使用适当的传代液来分离和重新悬浮细胞，确保传代液的成分和pH值适合细

胞的需求。

5.4.2传代操作规程

5.4.2.1细胞分离：使用适当的方法和试剂将细胞从培养皿中分离，避免细胞聚集和损伤。

5.4.2.2细胞计数：在传代过程中进行细胞计数，以确定传代液中的细胞密度。

5.4.2.3传代液的添加：将适量的传代液添加到细胞中，确保细胞在传代过程中获得足够的营养物质

和支持。

3

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5.4.2.4IPSC来源肝前体细胞传代操作应严格遵照《药品生产质量管理规范》和《干细胞制剂质量控

制及临床前研究指导原则》要求，保证无外源微生物污染。

5.4.3细胞传代记录和文档

5.4.3.1传代记录：记录每次细胞传代的信息，包括传代日期、传代液成分、细胞密度等。

5.4.3.2传代文档记录：建立细胞传代的文档记录，包括传代操作规程、传代液配方和传代效果的评

估。

5.4.3.3传代的质量控制：进行定期的传代质量控制，包括检查传代后细胞的健康状态和细胞数目。

细胞冻存

5.5.1IPSC来源肝前体细胞冻存操作应严格遵照《药品生产质量管理规范》和《干细胞制剂质量控制

及临床前研究指导原则》要求，保证无外源微生物污染。

5.5.2经制备数量达到冻存要求的IPSC来源肝前体细胞系可进行冻存操作，冻存细胞应加入适当的

冻存保护液，遵循程序降温原则，并在液氮中进行保存。

5.5.3冻存液成分应符合IPSC来源肝前体细胞分离与培养的基本要求，尽量采用国家已批准的临床

级产品或药品辅料，二甲基亚砜含量不得超过10%，如必须使用动物源性血清，应确保其无特定动物源

性病毒污染，严禁使用海绵状脑病流行区来源的牛血清。

5.5.4冻存细胞应标明干细胞名称、培养条件、代次、批次、操作人员、冻存日期等信息，并具有唯

一标识。

5.5.5液氮冻存应使用符合要求的液氮容器，气相冻存，由专人负责，保证液氮充足，温度恒定。

细胞复苏

5.6.1将冻存管从冷冻罐中取出后，尽快放入37℃～42℃水浴锅中，轻摇冻存管使其内容物在3min

内融化。用75%酒精擦拭冻存管外部后，将其移入无菌操作台内。

5.6.2将干细胞悬液转移至含有培养基的离心管中进行离心，去除冷冻保护剂。离心后用完全培养基

重悬干细胞，并将细胞按密度接种于培养瓶中，放入CO2培养箱培养。

5.6.3复苏后细胞的活率应不低于75%。复苏后细胞的接种密度应适宜。

制剂制备

5.7.1复苏检测合格的工作库细胞，按规定的接种密度进行接种、培养；融合度达到70%～90%时，按

规定的制剂类型制备成IPSC来源肝前体细胞制剂。

5.7.2按制剂质量标准进行检验，检验合格后进行制剂放行。

6质量鉴定

鉴定内容

6.1.1细胞形态

应呈克隆团生长、克隆边缘清晰、核质比高、形态均一，克隆内细胞与细胞之间接触紧密。

6.1.2染色体核型

正常核型应为46，XY或46，XX。

6.1.3细胞存活率

未冻存细胞存活率≥90%，冻存复苏后细胞存活率≥60%。

6.1.4细胞标志蛋白

细胞表面标志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的任意两个阳性率≥70.0%；细胞内部标志

物OCT4阳性率≥70.0%、NANOG阳性率≥70.0%。

6.1.5畸胎瘤形成

4

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应具备在体内形成具有三胚层结构的畸胎瘤的能力。

6.1.6微生物

真菌、细菌、支原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP应为阴性。

检验方法

6.2.1细胞形态

体外二维培养条件下，使用倒置相差显微观察。

6.2.2染色体核型

按《中华人民共和国药典》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”项检测。

6.2.3细胞存活率

按附录A进行检测。

6.2.4细胞标志蛋白

按附录B进行检测。

6.2.5外源重编程基因

按附录C进行检测。

6.2.6畸胎瘤形成

按附录D进行检测。

6.2.7微生物

6.2.7.1真菌、细菌

按《中华人民共和国药典》中“1101无菌检查法”项检测。

6.2.7.2支原体

按《中华人民共和国药典》中“3301衣原体检查法”项检测。

6.2.7.3HIV

按WS293核酸法检测。

6.2.7.4HBV

按WS299核酸法检测。

6.2.7.5HCV

按WS213核酸法检测。

6.2.7.6HTLV、EBV、HCMV

按《全国临床检验操作规程》核酸法检验。

6.2.7.7TP

按WS273核酸法检测。

6.2.7.8外源病毒因子检测

按《中华人民共和国药典》中“3302外源病毒因子检查法”项检测。

检验分类

5

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6.3.1批次质量检验

IPSC来源肝前体细胞制备机构应对同一生产周期、同一生产线、同一来源、同一代次、同一方法制

备出来的产品为一批，在同一批产品中随机抽取3个最小包装单元。制备机构应对每批次产品进行质量

检验，确保工艺和质量稳定合格。

6.3.2复核质量检验

IPSC来源肝前体细胞制备机构应对每一批次干细胞制剂单独留样保存，详细记录批号、代次、生产

日期、来源等信息。定期由国家或地方相关部门授权的专业细胞检验机构或实验室进行IPSC来源肝前体

细胞制剂的质量复核检验，并出具检验报告。复核质量检验报告出具时间应在该批次IPSC来源肝前体细

胞制剂提出放行申请之前，并作为放行检验参考。

评价结论

6.4.1批次检验结果全部符合6.1的规定，判定为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为

不合格品。

6.4.2复核检验结果全部符合6.1的规定，判定为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为

不合格品。

6

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A

A

附录A

（规范性）

细胞存活率检测细胞计数法

A.1仪器和设备

A.1.1显微镜。

A.1.2血球计数板。

A.2试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。

A.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。

A.2.2台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。

A.3检测步骤

A.3.1细胞悬液制备

根据检测需求，收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液(A.2.1)配制细胞悬液。

A.3.2细胞染色

按1：1的体积比将台盼蓝染液（A.2.2）与细胞悬液（A.3.1）混合均匀。

A.3.3细胞计数

将盖玻片盖在血球计数板（A.1.2）计数槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一侧计数室的盖玻片

边缘，另取10μL混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静置

30s，将计数板置显微镜（A.1.1）下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。

按照步骤A.3.2～A.3.3再重复测定一个样品。

A.3.4细胞存活率计算

细胞存活率按式（A.1）进行计算：

푀−푆

푋=×100%··································································(A.1)

푀

式中：

X——细胞存活率；

M——细胞总数；

S——染色的细胞数。

计算两次计数细胞存活率结果的平均值，记为细胞平均存活率。

A.4精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

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B

B

附录B

（规范性）

细胞标志蛋白检测细胞流式分析

B.1仪器和设备

B.1.1流式细胞仪。

B.1.2水平离心机。

B.1.3电子天平。

B.2试剂

本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。

B.2.1氯化钠（NaCl）：分析纯。

B.2.2氯化钾（KCl）：分析纯。

B.2.3无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）：分析纯。

B.2.4无水磷酸二氢钾（K2HPO4）：分析纯。

B.2.5多聚甲醛（PFA）：纯度95%。

B.2.6氢氧化钠（NaOH）：分析纯。

B.2.7牛血清白蛋白(BSA)：纯度≥98%。

B.2.8聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。

B.2.9抗体。

B.2.10使用电子天平（B.1.3）称量按照相应要求配制流式检测所需的液体：洗涤液、固定液、封闭

通透液、抗体稀释液。

B.3样品制备和保存

B.3.1洗涤液和固定后的样品于2℃～8℃保存。

B.3.2固定液放入分装容器中，密封并标记，按照相关试剂使用说明保存。

B.3.3相关抗体按说明书保存。

B.4检测步骤

B.4.1样品准备和固定

收集单细胞，使用水平离心机（B.1.2）250g，离心3min。弃上清，加适量固定液冰上放置10min，

使用水平离心机（B.1.2）取适量洗涤液洗涤3次～5次，每次3min～5min。

B.4.2封闭和通透

用封闭通透液重悬细胞并把细胞分成两等份，分别作为实验组和同型对照抗体组，冰上孵育20min，

然后用洗涤液清洗一遍。

B.4.3抗体孵育

按照抗体说明书进行稀释使用。

B.4.4过滤上机

用洗涤液重悬细胞，然后通过40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪（B.1.1）应用手册上机检

测。

B.4.5圈门设定原则

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首先根据颗粒度和透光性设门圈出目标细胞分群1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据同型对照

抗体组荧光强度，在分群1的基础上画出阳性细胞群2，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。同型对照

抗体组作为阴性对照。

B.5结果分析

得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。

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C

C

附录C

（规范性）

外源重编程基因定量PCR法

C.1仪器和设备

定量PCR扩增仪。

C.2试剂

C.2.1商品化定量PCR扩增试剂盒。

C.2.2商品化基因组DNA提取试剂盒。

C.2.3目标基因PCR引物。

C.3检测步骤

C.3.1提取样品基因组DNA。按照试剂盒说明书进行。

C.3.2使用DNA定量标准品使用定量PCR扩增仪(C.1.1)进行定量PCR扩增，建立目标基因检测标准曲

线。按照试剂盒说明书进行。

C.3.3使用样品基因组DNA使用定量PCR扩增仪(C.1.1)进行定量PCR扩增，检测目标基因浓度。按照试

剂盒说明书进行。

C.3.4参照标准曲线确定目标基因浓度。

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T/XXXXXXX—XXXX

D

D

附录D

（规范性）

分化潜能检测畸胎瘤形成法

D.1仪器和设备

D.1.1血球计数板。

D.1.2显微镜。

D.1.3水平离心机。

D.1.4电子天平。

D.1.5包埋机。

D.1.6切片机。

D.1.7展片机。

D.1.8载玻片。

D.1.9盖玻片。

D.1.10烘箱。

D.1.11通风橱。

D.2试剂

本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。

D.2.1磷酸盐缓冲液。

D.2.2消化酶。

D.2.34%台盼蓝染液。

D.2.4无水乙醇（C2H5OH）:分析纯。

D.2.5二甲苯（C8H10）:分析纯。

D.2.6石蜡（熔点60℃）。

D.2.74%多聚甲醛。

D.2.8苏木素染液。

D.2.9伊红染液。

D.2.10中性树胶。

D.3检测步骤

D.3.1细胞样品的准备

D.3.1.1细胞消化

离心收集细胞于离心管中，用生理盐水轻轻重悬细胞，避免形成气泡或残留细胞团块。

D.3.1.2细胞计数

根据附录A方法测定，计算细胞悬液活细胞浓度。

D.3.2细胞移植

用注射器将1×106～1×107个人诱导多能干细胞注射到6周龄～8周龄的免疫缺陷型小鼠皮下，或肌肉，

或睾丸白膜下的生精小管周隙，或肾背膜下等部位。

D.3.3畸胎瘤收样及处理

D.3.3.1收样

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人诱导多能干细胞注射约6周～10周后（确保畸胎瘤不超过荷载小鼠体重的15%）,对小鼠实施安乐

死。剥离受体小鼠上的畸胎瘤并进行切割（体积不大于5mm×5mm×2mm）,将畸胎瘤组织块用4%多聚

甲醛进行4℃过夜固定。

D.3.3.2石蜡切片及HE染色

对上述固定好的样本进行HE染色，镜下观察并拍照。

D.4结果分析

观察到来源于3个胚层的组织，包括内胚层来源的消化道上皮腺体样组织、中胚层来源的软骨组织，

以及外胚层来源神经组织等，即证明所接种的人诱导多能干细胞具有体内向3个胚层组织分化的多能

性。

12

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参考文献

[1]干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）（国卫办科教发〔2015〕46号）

[2]WHO实验室生物安全手册(第三版)

[3]药品生产质量管理规范（卫生部令第79号）

[4]中华人民共和国药典（2020年版）

13

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目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义、缩略语.................................................................1

4基本要求...........................................................................1

5制备过程...........................................................................2

6质量鉴定...........................................................................4

附录A（规范性）细胞存活率检测细胞计数法............................................7

附录B（规范性）细胞标志蛋白检测细胞流式分析........................................8

附录C（规范性）外源重编程基因定量PCR法..........................................10

附录D（规范性）分化潜能检测畸胎瘤形成法...........................................11

参考文献.............................................................................13

I

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IPSC来源肝前体细胞制备及质量鉴定规范

1范围

本文件规定了IPSC来源肝前体细胞的术语和定义、基本要求、制备过程、质量鉴定。

本文件适用于IPSC来源肝前体细胞的制备与质量鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB3095环境空气质量标准

GB19489实验室生物安全通用要求

GB50073洁净厂房设计规范

GB50346生物安全实验室建筑技术规范

GB50591洁净室施工及验收规范

3术语和定义、缩略语

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

诱导多能干细胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人体细胞经重编程而获得的具有自我更新能力和向三胚层细胞分化潜能的一种干细胞。

3.1.2

冻存cryopreservation

经过程序降温冷冻，并利用深低温冷冻储存技术，以减少细胞代谢活动，保存细胞生物学活性。

3.1.3

复苏thawing

细胞从脱离生长状态重新获得生长活力的过程。

3.1.4

细胞活率cellviability

能够增值、保持正常代谢活性的细胞占全部细胞的百分比。

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：诱导多能干细胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

场地与设施

1