DB32T-茅苍术工厂化育苗技术规程编制说明

江苏省地方标准《茅苍术工厂化育苗技术规程》编制说明一、标准编制背景及任务来源（一）标准编制背景（目的、必要性和意义）苍术是我国著名的传统药用植物，其药用部位主要是根茎，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等功效。活性成分精油中富含多种倍半萜化合物，药用价值主要体现在抗病毒、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力、抗炎等方面。在抗击新冠病毒疫情中涌现出了以“三方”为代表的有效中药方剂，而其中两方（化湿败毒方、宣肺败毒方）的主要成分即为苍术。除了药用价值，苍术及苍术精油还在日化用品、食品防腐、饲料添加、功能食品、香薰等领域中有着广泛的应用。最近几年，我国每年对苍术药材需求大约10000吨以上，目前市场年供应量不到5000吨，存在5000多吨缺口，每年仅药材原材料的市场缺额就在7.5亿元以上。此外，苍术提取获得的精油及其倍半萜产品具有抑菌、消炎、抗病毒、收缩毛孔、除皱祛纹、放松活络、促进代谢、抗皱抗衰老；调理脾胃、缓解风湿引起的关节疼痛、排毒养颜、抗溃疡、保肝等作用。此外，最近不断涌现出来的研究报道了苍术倍半萜还在减肥、抗癌等方面有着良好的效果。预计这些苍术加工产品的年市场份额在200亿元以上。野生资源已远远无法满足市场需求，组培和种植获得苍术原料将极大改变市场供应。苍术作为药用植物中一个非常重要的属，其在种的分类上又可分为茅苍术、北苍术、关苍术、朝鲜苍术、白术、鄂西苍术等，其中前五种可作药用，市场上的苍术药材一般指的是茅苍术和北苍术，其中尤以生长在江苏茅山及其周边地区的茅苍术品质最佳，是著名的道地药材。目前湖北、内蒙、陕西、河北等地都有或多或少的苍术种植和药材销售，市场所需的苍术药材主要由内蒙、湖北等地供应。但作为道地产区的江苏已有近30年没有形成苍术药材商品了。究其原因，最主要的原因在于野生道地茅苍术资源几近灭绝，目前已被列为江苏省4种濒危药用植物之一。传统苍术生产主要采用种子繁殖和根茎繁殖，但由于茅苍术基因多样性的原因，其结籽率很低，且种子萌发受到光照、温度、土壤含水量、土壤质量等因素影响较大，繁殖系数较低；根茎繁殖的弊端则在于根茎需求量较大、品质易退化，易发生病害等。近些年对茅苍术组培快繁技术的研究多有报道。植物组织快速繁殖因其具有培养周期短，取材少等优点可以用来繁育茅苍术。通过工厂组培快繁技术不仅能在短期内获得大量优质无菌苗，满足生产种苗需求，还能与生物技术育种结合选育高产优质的新品种，对缓解珍稀药用植物资源供需矛盾具有重要的意义。虽然目前药用植物组培育苗技术已较为成熟，但由于每种药用植物都有其独特的活性成分，自身的营养需求不尽一致，在实现工厂化育苗之前对其进行技术规范必不可少。鉴于苍术药材的市场需求较大且茅苍术的药用价值最高，针对茅苍术的大规模工厂化育苗技术亟需进行完善和规范。目前北苍术和湖北非道地产区所种植的茅苍术均已有相关地方标准出台，而作为道地产区的江苏尚无茅苍术种植或育苗的标准制定。为了解决苍术及其产品应用价值高和优质原料资源短缺之间的矛盾，保障江苏地区优质茅苍术药材的市场地位，制定茅苍术优质种质资源的相关标准迫在眉睫。本标准拟采用工厂化组培技术繁育获得大批量优质茅苍术种苗资源，标准的实施可望在短期内解决优质市场茅苍术资源短缺的问题。（二）项目来源2023年8月江苏省市场监督管理局下发《省市场监管局关于下达2023年度江苏省地方标准项目计划的通知》（苏市监标〔2023〕173号）。南京师范大学为标准编制承担单位，参编单位有南京倍萜源生物科技有限公司、江苏靖博生物技术有限公司等组成标准编制组。二、编制工作过程（一）资料收集阶段时间：2023年3月—2023年5月。工作安排：收集茅苍术工厂化育苗生产的组织培养、炼苗、穴盘苗生产、种苗标准、包装运输、生产档案等相关法律、法规、标准与规范、要求等技术资料。（二）调查研究与分析阶段时间：2023年5月—2023年7月工作安排：1、编制标准大纲与有关要求，明确标准编制组人员分工。2、编制标准编制工作方案。3、研究茅苍术工厂化育苗生产的组织培养、炼苗、穴盘苗生产、种苗标准、包装运输、生产档案等相关法律、法规、标准与规范、要求等技术资料，全面了解相关要求。4、调查研究江苏省内目前茅苍术工厂化育苗技术的工程案例。5、取证茅苍术工厂化育苗技术在江苏省内的实施成效，总结成功案例的技术要求。分析其推广应用可行性、成熟性、先进性，佐证其创造的生态、社会与经济效益。（三）标准编制时间：2023年8月—2023年9月自2023年8月，南京师范大学接到江苏省市场监督管理局下发《省市场监管局关于下达2023年度江苏省地方标准项目计划的通知》（苏市监标〔2023〕173号）后，2023年9月，南京师范大学会同南京倍萜源生物科技有限公司、江苏靖博生物技术有限公司联合成立标准编制组，确定了主要标准制定原则、制定大纲、人员分工、进度计划以及实施方案，确定《茅苍术工厂化育苗技术规程》标准框架。编制组依据标准编制实施方案及职责分工，通过资料收集、调查研究与分析等工作，结合茅苍术工厂化育苗过程及产品应用中面临的技术问题，认真开展了标准初稿的编制工作，于2023年9月完成了标准初稿的编制。（四）标准研讨时间：2023年9月—2023年10月通过多次研讨和专家咨询，发现了标准初稿中存在的问题，提出了相关建议，编制组通过进一步的资料收集和专家咨询，对标准的内容、框架、格式等进行了修改、补充和完善，并对标准内容进行了修改。形成标准征求意见稿。研讨修改情况如下：1补充更新了规范性引用文件。2对术语和定义进行了部分更正和补充、调整。（五）征求意见时间：2023年10月—2023年11月为广泛征求各方意见，拟于2023年10月31日起至2023年11月30日，标准编制组通过南京师范大学科学技术研究院面向社会公开征求意见。（六）专家研讨标准编制组于2023年12月组织召开《茅苍术工厂化育苗技术规程》地方标准研讨会。根据收集的征求意见，在对标准修改、补充、完善的基础上，标准编制组对标准主要内容及编制情况进行详细介绍，与会代表和专家提出标准存在问题，对标准内容展开讨论，从标准内容、格式规范、语言表述等方面提出修改意见。会后，标准编制小组根据专家意见对标准文本进一步修改完善，形成标准送审稿，并提交江苏省市场监督管理局和江苏省农业农村厅，等待审查。三、标准编制原则及主要技术内容确定（一）标准编制原则本标准与国家和行业相关标准不冲突，标准编制过程中，严格遵守相关标准特别是强制性条文的有关规定，本标准是对国家和行业标准的综合应用和补充。本标准按GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求进行编写。（二）主要内容1适用范围标准规定了茅苍术工厂化育苗生产的组织培养、炼苗和穴盘苗生产、种苗标准、包装运输、生产档案等内容。标准适用于茅苍术工厂化育苗技术与管理的全过程。2主要技术指标标准明确和规定了茅苍术无菌组培苗和炼苗的培养方法，穴盘苗生产方法，病虫害防治，以及种苗检测和包装运输过程。关于规范性引用文件，包含以下规范文件：GB3095环境空气质量标准《中国药典》2020年版，第一部药材和饮片，168苍术3术语和定义规定了茅苍术、组培苗、炼苗、工厂化育苗的术语定义，详见文本内容。（三）主要技术内容的说明本标准制定参考了目前已有湖北、河北、甘肃等省关于北苍术栽培技术的地方标准，以及湖北十堰市制定的湖北茅苍术的种子育苗和分株繁殖栽培地方标准，GB3095环境空气质量标准、《中国药典》2020年版，第一部药材和饮片，168苍术等现有规范文件。根据产地调研及文献查阅结果，结合本课题组研究数据进行对比分析，综合相关信息对标准中的核心指标数据进行确定，旨在为高品质中药材茅苍术的工厂化育苗提供科学数据与理论依据。1茅苍术无菌组培苗体系的建立茅苍术无菌组培苗由本课题组参考各类药用植物无菌组培苗处理方法的基础之上建立。选择健壮、无病虫害的野生或栽培茅苍术植株，外植体进行表面灭菌处理：取其叶芽，流水冲洗，在超净台中将叶芽依次浸泡于75%乙醇、9%次氯酸钠溶液、75%乙醇，随后无菌水冲洗3遍。按照该方法处理可获得经多次传代仍能保持稳定生长的无菌组培苗，本课题组将2007年从江苏茅山和汤山取样的100株茅苍术野生苗制备得来的无菌组培苗传代至今，仍保持稳定性状。图1茅苍术无菌组培苗培养基中大量元素的含量影响茅苍术的生长和活性成分，改善培养基配方中的大量元素含量配比，可以有效调整组培苗中挥发油的含量。MgSO4的含量变化对茅苍术的组培苗干重积累无明显影响，但影响根总长。CaCl2含量为原含量两倍时，干重、根数及根总长均最大。而KNO3的含量在原含量1.5到2倍时，组培苗的干重显著提高，2倍条件下的植株比1倍含量条件下植株干重高95.7%。NH4NO3含量为原含量的1到1.5倍间，干重与其他含量下的干重有显著性差异，KH2PO4则在2倍处有一个最大干重积累量（表1）。我们还发现不同元素含量处理条件下会影响茅苍术总挥发油及其主成分变化（表2），其中CaCl2含量为原含量1.5倍时挥发油含量最高，而MgSO4含量为原含量1到1.5倍时，挥发油含量最高。KNO3高含量促进植株生长，因此含量为原含量2倍时，每株茅苍术所含挥发油含量最大。而NH4NO3不存在时不利于植株生长，高含量不利于挥发油的产生。KH2PO4也表现为高浓度促进茅苍术生长，不利于几种主成分的积累，虽然最终每株茅苍术所含的总挥发油含量在高浓度时最高。经过响应面法设计优化实验结果显示，当几种影响较为显著的大量元素含量之间进行含量配比优化，可以显著提高茅苍术挥发油的总含量，通过以上优化，茅苍术活性成分可提高50%以上。表1培养基不同大量元素及不同含量对茅苍术干重及根部生长的影响MS培养基大量元素含量根总长(cm)根数干重(g)折干率(%)（×倍数）CaCl2014.53±1.36a4.33±0.58a0.042±0.002a12.089%±0.43ab0.517.67±1.04abc5.33±0.58a0.055±0.003abc11.63%±0.28a123.63±2.06d6.00±0.82a0.054±0.005d12.62%±0.52b1.521.81±1.35cd5.00±1.15a0.058±0.005cd11.41%±0.23a245.79±1.30l8.00±1.73b0.062±0.005l11.63%±0.31aNH4NO3017.63±0.87abc7.33±1.53ab0.028±0.003abc16.61%±0.01c0.537.34±4.15gh7.00±1.00ab0.039±0.004gh7.69%±0.01a139.57±4.27hi11.00±1.00b0.060±0.007hi29.98%±0.03d1.531.45±1.55f8.00±4.76ab0.067±0.003il12.86%±0.01b224.88±2.21de3.00±1.00c0.025±0.003de13.38%±0.01bKNO3029±2.11ef9.00±1.00ab0.054±0.002ef13.57%±0.01a0.533.01±5.81fg10.67±2.52b0.047±0.001fg14.62%±0.66a129.61±2.20f9.67±1.53ab0.046±0.003f15.03%±0.32a1.544.75±3.40l7.67±0.58a0.082±0.006m13.75%±0.74a241.96±3.72il10.50±0.58b0.09±0.004n13.23%±0.95aMgSO4015.76±1.53ab6.50±1.91a0.054±0.004ab24.79%±0.03a0.521.02±0.91cd7.33±1.53a0.062±0.004l24.50%±0.03a121.61±1.24cd7.75±1.71a0.050±0.002cd23.57%±0.03a1.521.04±2.11cd5.75±1.71a0.051±0.004cd24.20%±0.03a220.33±1.78bcd5.33±0.58a0.041±0.006bcd21.80%±0.01aKH2PO4017.99±1.75abc3.67±0.58a0.026±0.005abc16.24%±0.21a0.546.6±4.01d9.50±1.29b0.061±0.006ll14.00%±0.72bc123.22±1.35l5.67±1.15c0.051±0.005cd13.39%±1.40c1.533.41±2.40fg8.67±1.15b0.055±0.003fg14.87%±0.54b228.91±1.99ef7.75±0.96b0.079±0.005m12.87%±0.66c表2不同大量元素不同含量对茅苍术组培苗挥发油主成分含量的影响大量元素浓度（×倍数）姜毕烯(μg/g)茅术醇(μg/g)β-桉叶油醇(μg/g)苍术酮(μg/g)苍术素(μg/g)CaCl20.055.22±5.31a2.17±0.29a7.24±2.11a3.79±0.65a10.34±1.61a0.5191.60±60.65b1.81±0.55a18.94±4.76bc5.04±2.18a70.62±20.93b1.065.19±11.77b2.16±0.60a17.05±3.63ab5.46±2.02a47.67±1.98c1.5115.95±25.70b2.76±0.16a21.38±5.57cd5.08±1.51a90.20±6.12b2.0106.19±29.87b2.09±0.33a28.25±3.48d5.22±0.16a47.50±13.07cNH4NO30.0122.59±4.24a2.27±0.45a64.54±26.17a4.69±0.08ab86.66±18.30a0.5149.45±14.95a3.06±1.08a55.61±15.75a8.66±0.60c91.67±2.08a1.080.21±33.26b1.93±0.51a43.43±11.61ab4.24±0.93a35.43±10.73b1.562.05±7.67b2.27±0.65a42.16±8.80ab5.56±0.78b51.99±10.09b2.047.18±4.41b2.21±0.55a22.69±9.00b4.28±0.13a31.00±7.86bKNO30.0111.48±25.67ab2.87±0.06c34.39±4.07c5.23±0.74a48.85±14.62ab0.5153.49±10.82c2.67±0.41bc18.38±8.67ab7.43±1.82bc68.86±5.68a1.0148.65±49.71bc2.00±0.44ab10.57±0.62a8.52±1.08c59.75±16.80a1.594.06±6.50a1.91±0.47a23.27±6.57b7.37±0.76bc34.92±8.60b2.0125.52±17.30c2.60±0.40abc35.57±0.99c6.65±0.33ab59.24±10.46aMgSO40.080.5±46.77a2.28±0.67a17.73±7.56a7.08±2.75a20.48±6.47a0.582.29±19.93a2.79±1.15a33.79±11.68b6.64±0.95a40.98±15.00bc1.0114.83±11.26a3.02±0.85a25.43±10.25ab5.85±0.93a54.89±10.60c1.591.02±25.22a2.74±0.94a14.17±1.98a5.41±0.83a33.73±1.67ab2.0135.50±29.00a3.19±1.67a10.96±1.05a4.79±0.19a28.43±4.08abKH2PO40.065.96±4.45a5.09±1.97a23.35±13.54a6.99±0.49a194.23±89.69a0.596.53±22.26ab2.88±0.23b34.58±8.42a7.54±1.57a44.50±4.27b1.0105.49±6.66abc2.33±0.49b25.30±5.49a6.51±2.56a37.98±9.39b1.5147.34±45.47c1.96±0.16b27.73±6.78a5.71±1.28a45.98±18.53b2.0140.18±16.62bc2.41±0.47b32.52±12.63a6.91±1.54a47.17±14.25b2茅苍术炼苗、穴盘苗培养及病虫害防治本课题组对茅苍术组培苗的炼苗方法进行了长期的优化和实践，经过光照培养箱无菌组培→人工气候箱蛭石扩大培养→穴盘苗培养→田间种植的逐级适应和放大，炼苗存活率可达90%以上。组培室炼苗与穴盘苗培养时，病虫害防治对象主要是蚜虫，根据课题组经验及参考其他药用植物组培情况，应以物理防治为主，可采用粘虫板、杀虫灯诱杀害虫。图2茅苍术炼苗与穴盘苗培养3茅苍术的种苗检测本课题组的大量实验结果表明，炼苗和穴盘苗培养2个月左右，90%以上的茅苍术种苗外观可达到：叶片≥15片，株高≥10cm，根长≥5cm，无损伤、无烂根、无病害。为了确定茅苍术种苗中所含挥发油的主成分，本课题组使用气质联用技术并结合气相色谱方法对该组培苗系的挥发油主成分进行定性及定量分析，并进行定量测定的线性及范围考察，以及精密度、重复性、稳定性、准确性考察。建立了各类文献中公认的茅苍术中的4种主要活性成分：β-桉叶油醇、茅术醇、苍术酮、苍术素的定量分析方法。茅苍术种苗挥发油中有85个组分，其中含量大于1%的有21个（图3）。从总离子流图中可以看到，茅术醇（峰11）、β-桉叶油醇（峰12）、苍术酮（峰13）、苍术素（峰15）占总挥发油含量的10%左右。除此之外，还对其他多种活性成分（以倍半萜为主）进行了定性定量分析。图3茅苍术组培苗挥发油总离子流图表3茅苍术组培苗挥发油主成分编号保留时间（min）化合物名称分子式分子量相对含量（%）19.2501-乙基-3-(1-丙烯基)金刚烷（1-etyhl-3-(1-propenyl)adamantane）C15H24204.350.187229.424β-广藿香烯（β-patchoulene）C15H24204.350.069939.618十氢-4α-甲基-1-亚甲基-7(1-甲基亚乙基)萘（4α-methyl-1-methylene-7-(propan-2-ylidene)decahydronaphthalene）C15H24204.350.8973410.932δ-愈创木烯（δ-guaiene）C15H24204.352.2845511.215反-丁香烯（β-caryophyllene）C15H24204.351.9807612.019(1Z,4Z,7Z)-1,5,9,9四-甲基-1,4,7-环十(三)烯（(1Z,4Z,7Z)-1,5,9,9-tetramethylcycloundeca-1,4,7-triene）C15H24204.350.7407712.6711-(1,5-二甲基-4-乙烯基)-4-甲基-苯（1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl-benzene）C15H22202.342.8328813.215姜毕烯（zingiberene）C15H24204.356.3303914.031β-倍半水芹烯（β-sesquiphellandrene）C15H24204.351.75051015.806氧化石竹烯（caryophylleneoxide）C15H24O220.351.19831118.272茅术醇（hinesol）C15H26O222.370.05911218.597β-桉叶油醇（β-eudesmol）C15H26O222.370.01031318.835苍术酮（atractylone）C15H20O216.321.22551419.870β-雪松烯（β-himachalene）C15H24204.350.54611522.053苍术素（atractylodin）C13H10O182.226.10121630.156亚麻酸（(Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrienoicacid）C18H30O2278.4318.47511734.416δ-生育酚（2H-1-benzopyran-6-ol,3,4,-dihydro-2,8-dimethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl-,[2R-[2R*(4R*,8R*)]]）C27H46O2402.650.67131836.364γ-生育酚（2,7,8-trimethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)chroman-6-ol）C28H48O2416.683.0325表4茅苍术种苗内8种化合物气相色谱检测的线性、检测范围和最低检测限化合物线性范围回归方程R2检测限（mg/mL）反-丁香烯（β-caryophyllene）0.0003-0.03y=24251x-0.81140.99980.0001姜毕烯（zingiberene）0.0003-0.03y=28942x-1.77810.99950.0003β-倍半水芹烯（β-sesquiphellandrene）0.0005-0.03y=19826x-0.99790.99970.0001氧化石竹烯（caryophylleneoxide）0.0005-0.03y=26177x-13.2250.99940.0003茅术醇（hinesol）0.0005-0.03y=14737x-3.67740.99970.0003β-桉叶油醇（β-eudesmol）0.0005-0.03y=19327x-5.79350.99930.0003苍术酮（atractylone）0.003-0.03y=20625x-5.96650.99910.0001苍术素（atractylodin）0.0005-0.03y=15730x-3.47190.99980.0003表5茅苍术种苗内8种化合物气相色谱检测的精密度、重复性、稳定性和准确性化合物精密度a重复性a稳定性a准确性b反-丁香烯（β-caryophyllene）2.153.054.2195.57±2.56姜毕烯（zingiberene）2.453.474.55105.87±1.59β-倍半水芹烯（β-sesquiphellandrene）1.983.353.7897.77±3.08氧化石竹烯（caryophylleneoxide）1.662.673.9899.32±1.72茅术醇（hinesol）2.043.654.54103.65±3.34β-桉叶油醇（β-eudesmol）1.673.093.67100.32±2.51苍术酮（atractylone）1.852.725.6995.61±2.88苍术素（atractylodin）2.152.913.81103.35±2.18a相对标准偏差，%，n=6；b准确性=(总含量–原始含量)/添加量±SD，%，n=6。（四）标准主要指标数据确定根据本项目组以上研究结果，结合已有标准、研究文献，进行对比分析，形成茅苍术工厂化育苗技术规程。标准中主要指标数据确定如下：无菌组培苗培养外植体处理选择健壮、无病虫害的野生或栽培茅苍术植株，外植体进行表面灭菌处理：取其叶芽，流水冲洗，在超净台中将叶芽依次浸泡于75%乙醇、9%次氯酸钠溶液、75%乙醇，随后无菌水冲洗3遍。分化培养将冲洗干净的叶芽转移至含MS无菌分化培养基的组培瓶中。分化培养基组成为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤(2mg/L)+1-萘乙酸(0.3mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(10g/L)的固体培养基，每45天转接1次。组培室培条件为：光照强度3400lm/m2；光照时间12h/天，培养温度28/18℃。生根培养剪取分化培养基上茅苍术组培苗的丛生芽，移入生根培养基中。生根培养基的组成为：1/2MS培养基+1-萘乙酸(0.3mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(10g/L)，培养时间为60天。培养的环境条件同分化培养条件。炼苗与穴盘苗生产炼苗与穴盘培养将组培瓶在温室中封口放置2~3天，再瓶口半打开放置2~3天，最后瓶口完全打开放置1~2天。取出组培苗，放入水温为20℃左右的清水中，漂洗去除根部培养基，移栽至穴盘基质中并稍压紧。宜采用72孔育苗穴盘，穴盘的尺寸为54cm×28cm，穴盘基质为灭菌后的蛭石和营养土混合基质（体积比1:1）。穴盘中施入适量生根培养液，其组成为：1/2MS+1-萘乙酸(0.3mg/L)，每周洒水2~3次，湿润即可，培养60天。温室培养条件为：温度20℃左右，光照强度为18000lm/m2~20000lm/m2，相对湿度50%~70%。病虫害防治防治对象主要是蚜虫，以物理防治为主，采用粘虫板、杀虫灯诱杀害虫。种苗检测外观叶片≥15片，株高≥10cm，根长≥5cm，无损伤、无烂根、无病害。活性成分气相色谱检测种苗化学成分特征，应能检测出苍术酮、茅术醇、β-桉叶油醇和苍术素4种