生物学案：基因工程的基本操作程序

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精1．2基因工程的基本操作程序1．简述基因工程的原理及基本操作程序。2．尝试设计某一转基因生物的研制过程。一、目的基因的获取1．从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同______的DNA片段导入________的群体中储存，各个________分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因文库包括两种：________文库，即包含一种生物所有基因的文库；________文库，即只包含一种生物的一部分基因的文库，如______文库。2．利用PCR（1）PCR的含义:是一项在生物______复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：短时间内大量扩增目的基因。(3）原理：__________。（4）过程：第一步,加热至90～95℃，________________。第二步，冷却至55～60℃，________________________________________________。第三步，加热至70～75℃，________________________________________________。如此重复循环多次.（5）特点：指数形式扩增。3．用化学方法人工合成如果基因比较____，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：必须有启动子、________、终止子以及________等。1．启动子启动子是一段有特殊结构的______片段,位于基因的首端，是____________________的部位,可驱动基因______。2．终止子终止子也是一段______短片段，位于基因尾端,使______在需要的地方停止。3．标记基因标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有________，从而将含有________的细胞筛选出来。三、将目的基因导入受体细胞1．转化________进入受体细胞内,并且在受体细胞内________和______的过程,称为转化。2．常用的导入方法(1）将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________转化法，其次还有________法和__________法。（2)将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是______技术.此方法的受体细胞多是________。（3）将目的基因导入微生物细胞：______处理法。①用________处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中________的生理状态，这种细胞称为________细胞.②将重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程.四、目的基因的检测与鉴定1．首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了______，方法是采用__________技术。2．其次还要检测目的基因是否转录出了______,方法是采用________技术。3．最后检测目的基因是否翻译成________，从分子水平检测的方法是采用______________技术。4．有时还需进行__________水平的鉴定.如需要做抗虫或抗病的接种实验等.答案：一、1。基因受体菌受体菌基因组部分基因cDNA2．（1）体外（3)DNA双链复制（4）DNA解链为单链引物与两条单链DNA相应互补序列结合热稳定DNA聚合酶（Taq酶)从引物起始进行互补链的合成3．小二、目的基因标记基因1．DNARNA聚合酶识别和结合转录2．有特殊结构的DNA转录3．目的基因目的基因三、1。目的基因维持稳定表达2．（1）农杆菌基因枪花粉管通道（2）显微注射受精卵(3）Ca2＋Ca2＋DNA分子感受态四、1。目的基因DNA分子杂交2．mRNA分子杂交3．蛋白质抗原-抗体杂交4．个体生物学1．基因、基因文库、目的基因的比较(1)基因：基因是有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的遗传物质的结构和功能的基本单位，基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息.（2）基因文库：①构建：基因组DNA通过限制性核酸内切酶剪切后,对DNA片段进行密度梯度离心分级分离,分别导入受体菌的群体中储存。②目的:用以分析和分离特定的基因片段.③类型：基因组文库、cDNA文库。（3）目的基因:是指基因工程操作中需要的外源基因，它是编码某种蛋白质的结构基因，如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。2．基因表达载体的构建不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成,都遵循相同的碱基互补配对原则，A-T，G-C。3．目的基因的导入（1）不同受体细胞的常用导入方法生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的TDNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子(2）农杆菌导入法分析①完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。②重组的基因表达载体(重组质粒）导入农杆菌的常用方法是用Ca2＋处理法.③目的基因能够在植株细胞内稳定维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上。④由棉株细胞形成抗虫棉需要植物组织培养技术。质粒和重组质粒是两个不同概念，插入目的基因的质粒，称为重组质粒。4．目的基因的检测与鉴定检测内容检测方法备注外源DNA是否插入受体细胞染色体上DNA分子杂交从转基因生物体内提取DNA，用同位素或者荧光分子标记的目的基因与之杂交目的基因是否转录出mRNA核酸分子杂交从转基因生物体内提取mRNA，用标记的目的基因与之杂交目的基因是否翻译出蛋白质分子水平：抗原—抗体杂交从转基因生物体内提取蛋白质与相应抗体杂交个体水平：生物学功能鉴定抗虫、抗病的接种实验，与普通生物进行比较，检测是否有差异题型一cDNA的形成和PCR扩增的有关问题【例1】1970年,特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶.下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题。(1）催化①过程的酶是________；核酸酶H的作用是________。（2)③过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达90～95℃时才能完成，(3）由图中信息分析可知，催化②⑤过程的酶都是________,两者在作用特性上的区别是________。（4）如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25％，U占15％，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶________个。解析：根据图示可以看出，该过程是RNA在逆转录酶的催化作用下形成cDNA（负链DNA)，构成RNA—DNA中间体。中间体中的RNA再经过RNA酶H水解，而以剩下的负链DNA复制成双链DNA的过程。①过程是由RNA合成DNA的过程，需要逆转录酶进行催化。②过程是以单链DNA复制获得双链DNA的过程需要DNA聚合酶催化。⑤属于双链DNA复制的过程，需要DNA聚合酶催化。⑤过程在70～75℃环境下进行,所需要的酶应该能够耐高温。答案：（1）反转录酶（或逆转录酶）分解RNA(2）稳定（3）DNA聚合酶催化⑤过程的酶耐高温（4)60题型二基因工程操作的具体步骤【例2】（2010·江苏卷）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点图1图2（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后,分别含有________个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多,质粒的热稳定性越________.（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________________________________________________。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止____________________。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了__________________________.解析:（1）切割前质粒为环状,不含游离的磷酸基团。切割后质粒成了一个链状的双链DNA分子，含两个游离的磷酸基团。（2）因为SmaⅠ识别序列中均为G—C碱基对，G、C之间含三个氢键,热稳定性高。（3）据题图可知,SmaⅠ既会破坏标记基因，也会破坏目的基因。（4）若用同种限制性内切酶切割质粒和外源DNA中的目的基因，因为两端的黏性末端能够互补配对，会出现自身环化的情况。而用两种限制性内切酶切割，因为两端形成的黏性末端不能够互补配对，不会出现自身环化.(5）DNA连接酶可以连接具有能够互补配对黏性末端的DNA片段。（6）标记基因可以鉴别受体细胞是否含有目的基因。答案：(1）0、2(2）高（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化（5）DNA连接（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞1．下列有关基因工程操作的顺序组合中正确的是（）。①目的基因的检测与鉴定②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的获取A．①②③④ B．④③②① C．④②③① D．③④②①2．下列有关PCR技术的叙述正确的是().A．作为模板的DNA序列不能在每一次扩增中重复使用B．作为引物的脱氧核苷酸序列不能在每次扩增中重复使用C．反应需要的DNA聚合酶不能在每次扩增中重复使用D．反应需要的DNA连接酶不能在每次扩增中重复使用3．下列不属于基因表达载体的组成部分的是（)。A．启动子 B．终止密码 C．标记基因 D．目的基因4．欲使目的基因迅速表达基因产品，最好将目的基因导入(）.A．植物细胞 B．细菌或真菌细胞 C．动物细胞 D．病毒5．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是()。A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带答案：1．C2．BPCR中模板DNA序列可反复在每一次循环中用作模板;反应过程中需要的DNA聚合酶可重复使用；反应不需要DNA连接酶；而每一次循环用到的引