生物学基本技能 教案Ⅺ 染色剂和染色

基本技能Ⅺ染色剂和染色一、目标与任务本次教学主题基本技能Ⅺ染色剂和染色学时授课班级授课日期授课地点主讲教师实验目的1.规范操作常用的染色技术。2.掌握常用染色剂的配制方法技能分解生物学常用的染料常用染液的配制常用的生物学染色技术实验操作实训思政元素遵循操作规范；追求科学、创新，提升成就感教学方法讲授法、演示法、讨论法、案例分析法、课堂观摩法、实训法教学媒体教材、课件、教案、多媒体、投影仪二、教学进度教学过程教学内容教学活动教学时间（分钟）教师活动学生活动理论知识讲授一、生物学常用的染料（一）天然染料天然染料主要来源于植物、动物、微生物或天然彩色矿石，其特征是一般可以自然降解，大部分无毒性，不污染环境。生物学实验所用的天然染料多为植物染料。·苏木精（hematoxylin）。是南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸渍出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，被染材料必须经金属盐的媒剂作用后才有着色力，所以在配制苏木精染色时一般都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝铵（铵明矾）、硫酸铝钾（钾明矾）等。苏木精是染细胞核的优良材料。用酸性溶液（如盐酸\|酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色；用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。·洋红（carmine）。又叫胭脂红或卡红，是将一种产自热带的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质而制成的染料。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。洋红是细胞核的优良染料，适于小型材料的整体染色。·番红（safranine）。是从藏红花柱头中提取的一种天然染色剂，为橙红色粉末，可溶解于水和乙醇。常用于组织学和细胞学的生物染色，能对植物的木质化、栓质化和角质化部分进行染色，能将细胞核、染色体和花粉外壁等染成鲜艳的红色，其常与固绿等进行合作染色。番红在分析化学中也被用作氧化还原指示剂。（二）人工染料人工染料主要是人工合成的一类染料，其缺点是经日光照射后容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，能保持多年不褪色。二、常用染液的配制（一）吕氏（Loeffer）碱性美蓝染液配制（三）革兰氏（Gram）染液配制（1）草酸铵结晶紫染液（2）卢戈（lugol）碘液（3）脱色液：95%乙醇溶液。（4）番红复染液（四）芽孢染液（sporestainingsolution）配制（1）孔雀绿染液（2）番红水溶液（3）苯酚品红溶液（4）黑色素溶液（五）荚膜染液（capsulestainingsolution）配制（1）黑色素水溶液（2）番红染液：与革兰氏染液中番红复染液配制法相同。（六）鞭毛染液（flagellumstainingsolution）配制（1）硝酸银鞭毛染液（2）Leifson鞭毛染液三、常用的生物学染色技术（一）植物组织染色（planttissuestaining）植物组织染色的常用方法是番红-苯胺蓝（或固绿）二重染色法。（二）植物细胞染色（plantcellstaining）植物细胞的体积微小，且含有较高比例的水，故大多是无色透明的，如果不经染色处理，在显微镜下难以看清细胞的结构。因此，要观察某种细胞时，通常先进行染色处理。在普通光学显微镜下可见的细胞基本结构一般为细胞膜、细胞质和细胞核等。（1）细胞核染色。植物细胞核的染色常用浮尔根染色法、番红-结晶紫-橘红G三重染色法以及苏木精染色法等。（2）鉴定植物细胞死活。死细胞和活细胞不但透性不同，而且pH等情况也不同，对某些染料的反应明显不同。某些染料能在活细胞的细胞液中积累，却不能染活的原生质，但能使死细胞的原生质染色而不积累于液泡，所以可根据某些染料活体染色的情况来鉴定细胞死活。（三）植物细胞器染色（plantorganellestaining）在真核细胞中存在着多种具有特殊形态结构和功能的细胞器，如线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体、中心体、核糖体等。这些细胞器中有的经过特殊的染色后在光镜下就可被观察到，而有些细胞器由于体积非常小，只有在电镜下才可观察到。（1）线粒体染色。线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色。这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。以洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色为例介绍具体操作方法。（2）液泡染色。中性红为弱碱性染料，对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中某些蛋白质有关。（四）植物细胞染色体染色（plantchromosomestaining）（1）浮尔根染色浮尔根（Feulgen）染色是鉴别细胞核中DNA的组织化学方法,其原理与希夫试剂的化学性质有关。以蚕豆根尖细胞染色体染色为例介绍浮尔根染色的具体操作。（2）醋酸洋红染色（3）铁明矾-苏木精染色该染色方法是在根尖细胞有丝分裂染色体计数中效果最好的一种方法。（4）改良苯酚品红染色根尖解离后，将根尖放在载玻片中央，用刀片将根冠和伸长区切除，只留乳白色的分生区，滴上一滴改良苯酚品红染液，染色8～15min后，盖上盖玻片。用吸水纸放在盖玻片上，左手按住载玻片，右手拇指在吸水纸上对准根尖部位施加压力，使材料均匀分散。（五）动物组织染色（肝脏的组织染色法——Mallory苯胺蓝染色法）（六）动物细胞染色（animalcellstaining）（1）细胞核染色：常用的染料有甲苯胺蓝、苏木精、胭脂红、番红、甲基绿、结晶紫等。以人口腔黏膜上皮细胞为例介绍甲苯胺蓝染色法。（2）鉴定细胞死活（台盼蓝染色法）细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝（trypanblue）是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。（七）动物细胞器染色（animalorganellesstaining）（1）线粒体染色（人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色观察）（2）高尔基复合体染色高尔基复合体可用硝酸铀染液、硝酸钴-硝酸银染液、氯化铬-甲醛染液、升汞-锇酸染液等染色。以硝酸钴-硝酸银染液染色法为例介绍高尔基复合体染色步骤。（八）动物染色体染色（animalchromosomestaining）有姬姆萨染色法、苯酚品红染色法、醋酸洋红染色法、浮尔根染色法四种。（九）细菌的简单染色（bacteriasimplestaining）（1）原理在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料在电离时，其分子染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，故可用单一的碱性染料对细菌进行染色。（2）材料和器材仪器：显微镜、酒精灯等。实验材料：菌种为枯草芽孢杆菌、四联球菌；染剂为齐氏石碳酸复红染液。（3）操作步骤（4）结果观察（十）革兰氏染色（gramstaining）（1）原理由于细菌细胞壁的结构和组成不同，革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。将碘液作为媒染剂，其能与结晶紫结合成结晶紫和碘的复合物，增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解类脂质，增加细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细菌被脱色，再经番红复染后呈红色。革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。（2）材料和器材仪器：显微镜、酒精灯等。实验材料：菌种为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌；染剂为草酸铵结晶紫染液、番红染液；媒染剂为碘液；脱色剂为95%乙醇。（3）操作步骤（4）结果观察（十一）细菌芽孢染色（bacteriasporestaining）（1）原理芽孢壁厚、通透性差、不易着色，无法用单染色的方法使其着色，用着色力强的染色剂孔雀绿或石碳酸复红，在加热条件下染色，染料不仅能够进入菌体，也能进入芽孢内。进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，使芽孢和菌体更易区分。（2）材料和器材仪器：显微镜、试管、电炉等。实验材料：菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；染液为石碳酸复红、黑墨汁（需过滤）。（3）操作步骤（4）结果（十二）细菌荚膜染色（bacteriacapsularstaining）（1）原理荚膜是包围细菌细胞的一层黏液性物质，具有明确的外缘，牢固附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。荚膜染色通常采用衬托染色法或负染法，即将菌体和背景分别着色，从而把不着色且透明的荚膜衬托出来。（2）材料和器材菌种：褐球固氮菌。染色剂：石碳酸复红、黑墨汁（已过滤）。其他：载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具、95%乙醇。（4）结果（十三）细菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）（1）原理细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1～0.2μm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能观察到。鞭毛染色的基本原理：在染色前先用媒染剂(如单宁酸或钾明矾)处理，让媒染剂沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色（如碱性复红、硝酸银、结晶紫）。常用的媒染剂由单宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。（2）材料和器材仪器：显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸等。实验材料：菌种为枯草芽孢杆菌（鞭毛周生）、铜绿假单胞菌（鞭毛端生）；染液为硝酸银鞭毛染色剂A液和B液、95%乙醇和蒸馏水。（3）操作步骤（4）结果（十四）细菌抗酸染色（bacteriaacidfaststaining）（十五）细菌细胞壁染色（bacteriacellwallstaining）（十六）淀粉染色（starchstaining）淀粉是白色无定形粉末，由直链淀粉（占10%～30%）和支链淀粉（占70%～90%）组成。直链淀粉能溶于热水而不呈糊状。支链淀粉不溶于水，热水与之作用则膨胀而成糊状。溶于水中的直链淀粉呈弯曲形态，并借分子内氢键卷曲成螺旋状，加入碘酒，碘分子便钻入螺旋当中空隙，与直链淀粉结合在一起，从而形成络合物。这种络合物能比较均匀地吸收除蓝光以外的其他可见光（波长范围为400～750nm），从而使淀粉变为深蓝色。（十七）糖类染色（sugarstaining）（1）斐林试剂。还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。（2）过碘酸希夫反应法。过碘酸是一种强氧化剂，过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基，乙二醛基继而与希夫试剂结合，希夫试剂本为无色亚硫酸品红复合物，与乙二醛基结合后形成紫红色反应物。颜色反应的深浅取决于组织内多糖（包括糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂等）的乙二醇分子的多少。（十八）脂肪染色（fatstaining）脂肪染色可用苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红O、苏丹黑等进行染色，常用的是苏丹Ⅲ染色法。（十九）蛋白质染色（proteinstaining）常用的蛋白质染色试剂有双缩脲试剂、考马斯亮蓝、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛。考马斯亮蓝染色法（coomassiebluestaining）又称为Bradford法，是Bradford