生物学基本技能 教案 Ⅶ 显微操作

基本技能Ⅶ显微操作一、目标与任务本次教学主题基本技能Ⅶ显微操作学时授课班级授课日期授课地点主讲教师实验目的1.了解各种显微镜的原理和结构。2.掌握一般显微镜的使用方法技能分解显微镜的分类显微镜介绍及其使用方法实验操作实训思政元素培养细微的观察力；提高动手操作能力教学方法讲授法、演示法、讨论法、案例分析法、课堂观摩法、实训法教学媒体教材、课件、教案、多媒体、投影仪二、教学进度教学过程教学内容教学活动教学时间（分钟）教师活动学生活动理论知识讲授一、显微镜的分类显微镜是由一个透镜或几个透镜组合构成的一种光学仪器，主要用于将微小物体放大至人的肉眼能看到。（一）显微镜的具体分类通常情况下，显微镜分为光学显微镜和电子显微镜两大类。常见的光学显微镜有普通光学显微镜、解剖显微镜、倒置显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜、视频显微镜、超声波扫描显微镜等。常见的电子显微镜有扫描电子显微镜、透射电子显微镜等。按使用目镜的数目可分为单目显微镜、双目显微镜和三目显微镜三大类。按其用途以及应用范围可分为生物显微镜、解剖显微镜、金相显微镜等。按光学原理可分为偏光显微镜和相差显微镜等。按光源类型可分为普通光学显微镜、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等。按显微镜物镜的位置又可分为正置显微镜和倒置显微镜等。（二）显微镜的应用领域（三）性能指标在显微镜的性能指标中最重要的是分辨率，其他如镜口率、放大率、焦点深度、镜像亮度和视野亮度也各有其重要意义。二、显微镜介绍及其使用方法（一）普通光学显微镜1.成像原理又称明视野显微镜，物镜和目镜的作用都相当于一个凸透镜。首先光射到物体上，再从物体射入物镜和目镜，最后射入观察者的眼睛，在此过程中成像并放大。成像过程为被检标本是放在物镜下方1～2倍焦距处，所以物镜可使标本在物镜上方形成倒立放大的实像。该实像正好在目镜下焦点以内，通过目镜又形成倒立放大的虚像；经过调焦可使该像在眼睛的明视距离内，最后通过眼球晶状体在视网膜上成为正立的像。2.结构特征在结构上分为光学、照明和机械三部分。光学部分是主要部件，决定光学性能，但仍需后两者的精密配合，才能有效地发挥作用。3.操作方法低倍镜、高倍镜、油镜4.注意事项（二）解剖显微镜1.成像原理解剖显微镜成像采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角体视角（一般为12°～15°），因而能形成三维空间的立体图像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为110mm）以及连续放大观看等特点。2.结构特征光学系统、机械系统3.操作方法4.注意事项（三）倒置显微镜1.成像原理倒置显微镜的组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜的焦距。目镜的作用与放大镜一样。不同的是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体在物镜已放大一次的像。2.结构特征主要分为三部分：光学系统、照明系统和机械系统。光学系统：物镜装在镜筒下端的旋转器上，一般有3～4个物镜；目镜装在镜筒的上端，通常备有2～3个。照明系统：反光镜、集光器、聚光镜、光圈。机械系统：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、物镜转换器、镜台、调节器。3.操作方法4.注意事项（四）暗视野显微镜1.成像原理也叫超显微镜，是利用丁达尔效应的原理（当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”,这种现象即丁达尔效应），在普通光学显微镜的结构基础上换装暗视野聚光器后改造而成的。暗视野聚光器，内部有一抛物面结构的遮挡,使照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。由于暗视野显微镜不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不可观察到任何物体；当有物体时，以物体衍射回的光与散射光进入物镜，在暗的背景中形成物体的明亮像。在暗视野显微镜下观察物体，照明光大部分被折回，由于物体(标本)所在的位置结构、厚度不同，光的散射性和折光有很大变化。2.结构特征反光镜、物镜、方位光阑、光源、暗视野的维持。3.操作方法4.注意事项（五）相差显微镜1.成像原理利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，可使人眼观察到无色透明物体中的细节。镜检时光源只能通过环状光阑的透明圆环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光由补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别使通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。2.结构特征环状光阑、相位板、中心望远镜、光源和滤光片3.操作方法4.注意事项（六）荧光显微镜1.成像原理它是一种较为常用的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。2.结构特征荧光显微镜观察由短波光（紫外、紫、蓝等）激发的生物物质或经荧光剂（荧光染料）标记（或染色）的物质所发生的荧光，它具备以下结构：能产生短波光的光源、激发滤光片、吸收（护目）滤光片等。3.操作方法（以XST-2型实验用荧光显微镜为例）4.注意事项（七）激光扫描共聚焦显微镜1.成像原理采用激光束作光源，激光束通过照明针孔，由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中如有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。2.结构特征在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等。3.操作方法（以瑞士徕卡公司的TCSSP5型激光共聚焦显微镜为例）4.注意事项（八）偏光显微镜1.成像原理（1）双折射性：当光线通过各向异性物质时，因照射光的方向不同，使光速、折射率、吸收光振动面和振幅均产生差别，具有这种性质的物质在光学上称为各向异性物质。这种物质又都具有双折射性，故也称双折射体。（2）光的偏振：自然光通过双折射体后变成只在一个方向上振动的光称为偏振光。（3）尼科尔棱镜：尼科尔棱镜是将具有一定方向性的两块方解石用树胶黏合而成的。（4）正交尼科尔棱镜下置放双折射体的明暗变化。（5）正交尼科尔棱镜下置放单折射体的明暗变化。根据上述原理，在偏光显微镜下可确定样品是双折射体还是单折射体。2.结构特征光源、特殊的载物台、干燥系物镜、目镜3.操作方法4.注意事项（九）视频显微镜1.成像原理当使用视频显微镜拍摄景物时，物体反射的光线通过视频显微镜的内置镜头透射到电荷耦合元件（CCD）上。当CCD曝光后，光电二极管受到光线激发而释放出电荷，生成感光元件的电信号。CCD控制芯片利用感光元件中的控制信号线路对发光二极管产生的电流进行控制，由电流传输电路输出，CCD会将一次成像产生的电信号收集起来，统一输出到放大器。经过放大和滤波后的电信号被传送到模数转换器（ADC），由ADC将电信号(模拟信号)转换为数字信号。数值的大小和电信号的强度与电压的高低成正比，这些数值其实也就是图像的数据。此时这些图像数据不能直接生成图像，还要输出到数字信号处理器(DSP)中。在DSP中，将会对这些图像数据进行色彩校正、白平衡处理，并编码为视频显微镜所支持的图像格式、分辨率，然后才会被存储为图像文件。2.结构特征主机架上有多处照明光源灯壳、照像装置、记录装置、电视发生器和光电元件的连接口，这些连接口与成像光路系统之间不可能同时接通光路。3.操作方法4.注意事项（十）超声波扫描显微镜1.成像原理利用超声波脉冲回波的性质，激励压电换能器发射出多束超声波通过耦合液介质传递到被测样品，声波的这种机械波传递过程类似电磁波，在经过不同介质时会发生折射、反射等，通过声阻抗不同的材料时会发生波形相位、能量变化等，经过一系列数据采集计算形成灰度值图像，可用来分析样品的内部状况。2.结构特征3.操作方法（以德国PVA超声波扫描显微镜为例）4.注意事项（十一）扫描电子显微镜1.成像原理2.结构特征由三大部分组成：真空系统、电子束系统和成像系统。3.操作方法4.注意事项（十二）透射电子显微镜1.成像原理2.结构特征包括电子光学系统、真空系统、电气系统、水冷却循环系统和压缩空气系统等。主体是电子光学系统，简称镜筒。3.操作方法4.注意事项板书；讲解；分析；提问；操作师范领会；选择性做笔记；思考、回答；练习实验操作实训（1）打印几种显微镜图片，要求学生识别出不同种类的显微镜，重点考察不同种类显微镜的结构区别。（2）让学生用普通光学显微镜观察常规切片标本