HIV抗体检测上岗培训教学课件

HIV抗体检测依据全国艾滋病检测技术规范

NationalGuidelineforDetectionofHIV/AIDS（2015年修订版）全国艾滋病检测工作管理1990.全国HIV检测管理规范（试行）1997.9.全国艾滋病检测工作规范2003.5.全国艾滋病检测技术规范（试行）

------“规范”

------“办法”？2004.8全国艾滋病检测技术规范2006.6全国艾滋病检测工作管理办法

------“办法”2009.9全国艾滋病检测技术规范（修订版）2015.12全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）

HIV-1新发感染检测一章；

4代试剂（抗原抗体联合检测试剂）的检测流程；

核酸检测流程；HIV-1核酸检测报告和婴儿艾滋病感染早期诊断检测报告

两章内容：实验室生物安全

艾滋病检测实验室质量管理。流行病检测HIV抗体检测报告单、艾滋病病毒抗体检测数和阳性人数统计报表、艾滋病职业暴露个案登记表和艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表；完善了不同的检测策略独立的一章增加了新增补充试验概念取消了主要内容2009年版第一章样品的采集和处理第二章HIV抗体检测第三章HIV-1抗原检测

第四章HIV核酸检测第五章HIV-1耐药检测第六章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测

第七章HIV-1的分离培养

第八章实验室生物安全第九章艾滋病检测实验室质量管理2015年版第一章样品的采集和处理第二章HIV抗体检测第三章HIV-1新发感染检测第四章HIV-1抗原检测第五章HIV核酸检测第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略第七章HIV-1基因型耐药检测第八章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测第九章HIV-1的分离培养

全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）勘误表1.第4页，4.3.5中，“时间不超过24小时”改为“时间不超过48小时”。2.第16页，5.4.1.1中，第二行“下表”改为“试剂盒规定的”。3.第29页，5.2.4.2中，第二行“报告检测值，”改为“报告检测值；”。4.第30页，5.3.1.6中，第二行“RNA1033CPs/ml”改为“RNA103CPs/ml”。5.第31页，6.3中，第五行“150003CPs/ml”改为“15000CPs/ml”。6.第36页，图4中，倒数第二个框的“无反应”下缺少连接报告HIV抗体阴性P24抗原阴性的箭头，改为下图，图4。7.第37页，4.2.2中第4行“结果有反应做抗体确证试验”改为“结果有反应做补充试验”；“结果无反应判为抗体阴性”改为“结果无反应判为HIV抗体阴性”。4.3.1.1中，第二行报告“HIV抗体阴性”改为报告“HIV-1抗体阴性”。8.第38页，文字倒数第一行图6后添加“此流程也可用于发光试剂试验”。9.第42页，6.1中，第二行取消“或EDTA抗凝全血”。10.第42页，图10中，倒数第二个框内删除“无反应”。11.第45页，图12中，第三个框下右边“无反应”改为“有反应”。

区分抗原抗体检测试剂抗体有反应抗原有反应抗体有反应抗原无反应抗体无反应抗原无反应

抗体无反应抗原有反应

抗体检测*

无反应

均有反应一有反应一无反应

补充试验HIV-1核酸试验或2~4周后随访图4区分抗原抗体检测试剂筛查检测流程

报告HIV抗体阴性，HIVP24抗原阴性抗体检测*均有反应一有反应一无反应

无反应第二章HIV抗体检测范围本章规定了HIV抗体的检测方法、结果报告、质量控制。适用于各级各类医疗、疾病预防控制、检验检疫、采供血及卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。

HIV抗体检测实验室要求应符合《全国艾滋病检测工作管理办法（2006年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。应符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。实验室的质量控制按本规范相关章节规定执行。HIV抗体检测的目的HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。研究HIV抗体检测的要点根据目的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室SOP。结果判定以试剂盒说明书为标准。筛查试验有反应，须做补充试验。筛查试验无反应，不应做补充试验。筛查及补充试验对象均应做好咨询工作。

补充试验是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体、抗原或者核酸而确定艾滋病病毒感染的检测方法。抗体确证试验（免疫印迹试验，条带/线性免疫试验））核酸试验（核酸定性和核酸定量试验）。特定条件*下的替代检测，包括三种酶联免疫试验、三种快速试验或酶联免疫加快速试验，免疫层析或免疫渗滤试验。*特定条件：高流行地区（流行率大于5%）、高危人群（如男男同性恋，吸毒人群）、三种试剂均经过使用地区中心实验室评价。我们省暂时不用此策略

达到保证措施的必要条件贯彻有关HIV检测的法规有效的检测方法和检测试剂常规质量控制和质量保证艾滋病检测实验室检测信息上报于每月5号前上报上一个月实验室检测数据至艾滋病综合信息管理系统和艾滋病检测实验室信息管理系统。<<艾滋病综合防治数据信息管理手册>>（2011年版）附件17未开展网络直报的单位，由县级疾病预防控制机构收集信息后统一上报。HIV感染的实验诊断检测方法HIV抗体检测，HIV-1抗原检测，HIV核酸检测，HIV-1分离培养。HIV抗体检测检测时间：窗口期两个阶段（筛查和确证）三个程序（筛查－复检－确证）六种标本（全血、血清，血浆，口腔黏膜渗出液，尿液，滤纸干血斑。）人类免疫缺陷病毒未经抗病毒治疗的病人HIV感染到死亡的自然史HIV感染后的血清学动态HIV抗原人IgG感染人IgM天周月年HIVRNAP24Ag常规HIV抗体检测的方法一、筛查方法1.酶联免疫吸附试验（ELISA/EIA）2.化学发光或免疫荧光试验3.快速检测（RT）及其它检测试验

明胶颗粒凝集试验（PA）免疫渗滤试验免疫层析试验检测抗体联合检测抗原抗体

酶标免疫技术(EIA)

人员培训

◎ELISA原理；

◎临床意义；

◎熟悉检测技巧，

◎熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；

◎熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。

◎二、抗体确证试验免疫印迹试验（WesternBlot)条带/线性免疫试验（RIPA/ lia）其他方法可用于确证的特定条件下的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验，免疫层析和免疫渗滤试验。每一代HIV试剂实验原理

固相载体血清样本YY第一代,第二代结合物微孔板HIV抗原抗-人IgG酶抗体每一代HIV试剂实验原理

固相载体血清抗体YYY第一代,第二代第三代结合物微孔板HIV抗原抗-人IgG酶抗体每一代HIV试剂实验原理

固相载体血清抗体YYYYYY第一代第二代第三代第四代结合物微孔板HIV抗原抗-人IgG酶抗体抗-p24单抗HIV“窗口期”第一代HIVAb:6-8星期HIV“窗口期”第一代HIVAb:6-8星期

第二代HIVAb:4-5星期HIV“窗口期”第一代HIVAb:6-8星期

第二代HIVAb:4-5星期第三代HIVAb:±3星期第四代HIVAb/Ag:±2星期HIV“窗口期”第一代HIVAb:6-8星期

第二代HIVAb:4-5星期第三代HIVAb:±3星期

酶联免疫吸附试验——加底物显色，用酶标仪测定结果。化学发光——加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定

明胶颗粒凝集试验（PA）：是HIV抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏的明胶颗粒，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验的阴性和阳性对照质控，需符合试剂盒的规定。凝集试验与ELISA的原理比较ELISAColor凝集试验凝集试验与ELISA操作步骤的比较ELISA凝集试验加入样品和稀释液第一步反应洗涤洗涤第二步：酶反应显色第三步：加入底物结果判读孵育凝集图像

免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状或线状固定在膜上，加待检样品，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点或条带。有效试验的质控点必须显色。免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。反应时间严格按试剂盒说明书要求执行。

结果报告筛查报告：使用附表1（HIV抗体筛查检测报告）筛查试验无反应报告为“HIV抗体阴性”；有反应必须进行复检，复检两次检测均无反应报告为“HIV抗体阴性”，复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行“补充试验”；报告为“HIV感染待确定”，不能出具阳性报告。HIV抗体筛查报告需由一名检验人员和一名审核者签字

确证报告：使用附表2（HIV抗体确证检测报告）。符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性”；符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性”；并按规定做好检测后咨询和疫情报告。符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性”。如疑似“窗口期”感染，建议进一步做HIV核酸检测或2-4周后随访，尽早明确诊断。符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定”，在备注中应注明“2-4周后复检”或尽快做核酸检测。

HIV抗体确证检测报告应在收到样品后的7个工作日内发出。

特定条件的用于确证的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验报告。见附表4。我们省暂时不用此策略质量控制：李向忠老师

范围：本章规定了艾滋病实验室的检测策略及结果报告。疫情监测相关的检测策略及结果报告；临床诊断相关的检测策略及结果报告；血液筛查相关的检测策略及结果报告。

第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略

疫情监测相关的检测策略及结果报告试剂-1有反应无反应试剂-2有反应无反应报告HIV抗体阳性报告HIV抗体阴性

图1

HIV匿名无关联检测流程情况一：HIV匿名无关联检测图1情况二：实名关联检测，需采取临床诊断相关检测策略及结果报告。

情况一：使用抗体检测试剂的检测流程图2临床诊断相关的检测策略及结果报告试剂-1有反应无反应试剂1双份或双孔检测或两种试剂*均有反应一有反应,一无反应均无反应

补充试验报告HIV抗体阴性

图2使用抗体检测试剂的检测流程

*两种试剂可以是原有试剂加另一种试剂，也可以是两种不同试剂。情况二：使用抗原抗体检测试剂的检测流程又分两种情形

用不能区分抗原抗体的试剂进行初筛见图3。结果无反应，报告“HIV抗体阴性、HIV-1p24抗原阴性”；结果有反应，不能出具阳性报告，必须进入复检试验。对初筛有反应的样品，用抗体检测试剂进行复检试验，结果有反应，进行抗体补充试验；结果无反应，2-4周后随访或进行HIV-1核酸试验、HIV-1P24抗原试验，（HIV-1核酸检测见本章4.3.2，HIV-1P24抗原试验见第四章）。

临床诊断相关的检测策略及结果报告不区分抗原抗体的检测试剂有反应无反应抗体检测*有反应无反应补充试验HIV-1核酸试验或P24抗原试验或2-4周后随访报告HIV抗体阴性P24抗原阴性图3使用不区分抗原抗体联合检测试剂的检测流程用可区分抗原抗体的试剂进行初筛见图4。抗原抗体结果均无反应，报告“HIV抗体阴性、HIVp24抗原阴性”；抗原抗体结果均有反应，进行抗体复检检测，结果有反应，做补充试验，结果无反应，进行HIV核酸试验或2-4周后随访；抗体有反应抗原无反应，进行抗体复检检测，结果有反应做抗体确证试验，结果无反应判为抗体阴性、P24抗原阴性；抗体无反应抗原有反应，2-4周后随访或进行HIV核酸或抗原试验。

临床诊断相关的检测策略及结果报告区分抗原抗体检测试剂抗体有反应抗原有反应抗体有反应抗原无反应抗体无反应抗原无反应

抗体无反应抗原有反应

抗体检测*

无反应

均有反应一有反应一无反应

补充试验HIV-1核酸试验或2~4周后随访图4区分抗原抗体检测试剂筛查检测流程

报告HIV抗体阴性，HIVP24抗原阴性抗体检测*均有反应一有反应一无反应

无反应

*抗体检测：试剂1双份或双孔检测或原有试剂加另一种试剂

补充试验检测策略补充试验分为抗体确证试验和HIV-1核酸试验。抗体确证试验免疫印迹试剂（WB）条带/线性免疫试验（RIBA/LIA），

特定条件下的替代检测（三种酶联免疫试验、三种快速试验或者酶联免疫加快速试验），免疫层析或免疫渗滤试验。HIV-1核酸试验定性试验定量试验

抗体确证试验检测流程免疫印迹试验(WB/RIBA)不确定阴性阳性出现HIV-2指示带图5免疫印迹试验流程核酸试验或2-4周后随访报告HIV-1抗体阴性报告HIV-1抗体阳性根据情况进一步检测HIV-2

如果使用以检测HIV-1抗体为主并含HIV-2指示带的抗体确证试剂，当出现HIV-2指示带，根据情况进一步检测HIV-2。HIV-2检测有两种方法，使用能够区分HIV-1和HIV-2的抗体确证试剂，根据试剂盒说明书直接判定结果。使用以检测HIV-1抗体为主的抗体确证试剂，只有1条HIV-2指示带，当检测结果出现HIV-2指示带时，根据具体情况决定是否进一步检测HIV-2：（1）HIV-1抗体阳性，报告HIV-1抗体阳性，不推荐再检测HIV-2；（2）HIV-1抗体不确定或阴性，需再用单纯的HIV-2抗体确证试剂或能区分HIV-1与HIV-2感染的确证试剂检测。

HIV-1核酸试验对HIV抗体复检试验有反应样品（见图2），进行HIV-1核酸试验，核酸检测结果无反应的样品，建议做抗体确证试验。抗体确证试验不确定或抗体阴性疑似急性期感染的样品，可进行两次HIV-1核酸试验。

核酸检测结果报告定性检测结果有反应，报告“HIV-1核酸阳性”；无反应，报告“HIV核酸阴性”。定量检测结果低于检测限，报告低于检测限；检测结果>5000CPs/ml，报告检测值；检测结果≤5000CPs/ml，建议重新采样检测，检测结果报告检测值。临床医生可结合临床及流行病史、CD4+T淋巴细胞检测值或HIV-1抗体随访检测结果等进行诊断或排除诊断。检测流程见图8。

HIV-1核酸检测HIV-1核酸定量检测有反应报告HIV-1核酸阳性无反应报告HIV-1核酸阴性低于检测限高于检测限图8HIV-1核酸试验流程HIV-1核酸定性检测报告低于检测下线>5000CPs/ml报告检测值≤5000CPs/ml，重新采样检测

血液筛查相关的检测策略及结果报告血站针对献血者及其捐献的血液进行HIV筛查的程序，依据GB18469－2012《全血及成分血质量要求》、《血站技术操作规程（2012版）》的相关规定执行。单采血浆站针对供血浆者和血浆产品的HIV筛查程序依据《单采血浆站技术操作规程（2011版）》的相关规定执行。所有不合格样本的进一步检测参照临床诊断检测策略。

婴儿HIV-1感染早期诊断相关的检测策略及结果报告核酸检测策略（RNA/DNA）及结果报告见图11。抗体检测策略及结果报告见图12。有反应有反应无反应无反应有反应有反应无反应艾滋病感染产妇所生儿童出生后6周采集第一份血样本制备成滤纸片干血斑(DBS)进行婴儿艾滋病感染早期诊断尽快采集第二份血样本，送检婴儿满3个月再次采集血样本，送检尽快再次采集血样本，送检报告“婴儿HIV感染早期诊断结果阴性”按照未感染儿童处理，继续提供儿童保健及随访服务；满12月龄开始进行抗体检测报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性”诊断儿童HIV感染，进行传染病信息报告提供转介服务图11艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期诊断试验流程无反应不确定有反应无反应有反应有反应无反应有反应有反应无反应无反应艾滋病感染产妇所生儿童12个月进行HIV抗体筛查试验用另一种筛查试剂再次检测18个月时再进行HIV抗体筛查试验试剂1双份或双孔检测，或原有试剂加另一种试剂抗体补充试验提供咨询，继续随访，进行核酸检测等补充试验图12艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程报告HIV抗体阳性报告HIV抗体阴性性强调---严格按照说明书操作---严格防止交叉污染---严格遵守实验室操作规程---严格执行实验室安全制度EIA结果判断OD值各孔OD值是通过某一波长的一束光自上而下照射，并检测被液体吸收的光的量。Cut-off值（临界值）是将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值。不同厂商、不同方法的试剂临界值计算公式不同。EIA结果判断有反应：样本的OD值＞CUTOFF值无反应：样本的OD值＜CUTOFF值不确定（灰色区）：CUTOFF值上下10%EIA影响因素反应时间温度酶结合物的稳定性EIA试验的优缺点优点

操作可以标准化

结果判定客观

重复性好，便于质量控制

一次检测样本多，节约时间

方便普查缺点

反应时间长，操作复杂

大包装，浪费大

设备PA的优缺点操作简便，不需任何辅助设备可以单人份操作SFDHIV1/2PA可同时检测HIV-1型（包括O群）和HIV-2型抗体。由于使用了重组抗原及明胶颗粒凝集技术，试剂的敏感性和特异性均较高。对HIV血清转化盘的研究显示：敏感性与酶免法相当特异性高于99.8%此法操作简便，不需特殊仪器出结果快特别适合在未产前检查的分娩孕妇、高危行为的求诊者、输血前的急诊者、边远地区供血者、VCT、急诊室、解剖室、殡仪馆以及意外暴露时追踪传染源等情况下使用。对于实验条件差，技术人员水平较低的发展中国家也较适用。但其敏感性、特异性均较ELISA法低，且检测结果结果用肉眼判读，易受主观因素的影响，不同的检验人员观察同一个结果可能会得出不同的结论，弱阳性结果常常较难判别。免疫渗滤、免疫层析的优缺点对筛查结果的解释筛查检测的目的是检出所有的阳性者，因此对筛查试剂的质量要求是敏感性必须好，在注重强调敏感性的情况下，特异性不可避免地受到影响。出现假阴性或假阳性结果，同时还有可能出现的技术误差等等。因此分析筛查结果时，必须全面考虑。筛查实验的阳性结果不能最终确定为HIV抗体阳性，必须做补充试验才能下结论。假阳性结果一些含有针对HLA抗原的抗体患自身免疫性疾病（如系统性红斑狼、风湿病等寄生虫（如疟疾等）其他病毒（如病毒性肝炎等）近期疫苗接种（如流感疫苗接种等）高丙种球蛋白症假阴性结果“窗口期”感染者严重的HIV相关免疫紊乱者血清转换期：一些病人在病程的晚期发生血清学转换，可能由于免疫系统的崩溃所致；也可能于HAART治疗导致免疫重建的病人IgG抗体缺乏者抗原量过量技术误差

实验中出现技术误差是难免的，特别是在一次做大批量检测时。血清标本或试剂稀释或配备不正确加样器污染或不正确加错标本临近孔交叉污染洗涤程序错误吸光检测不正确对确证结果的解释WB的检测结果是在转印条膜特异性HIV抗原的位置上出现深浅不同的条带，按照不同的的带型，最终结果可以判断为HIV抗体阳性、HIV抗体阴性、HIV抗体不确定。HIV抗体阳性：说明是真正感染了HIV，为HIV感染者或AIDS。HIV抗体阴性：①未感染HIV②“窗口期”感染者HIV抗体不确定：不仅筛查阳性的标本可以出现不确定的结果，筛查阴性的标本做WB检测时也有大约15%出现不确定结果，可能为下列几种情况。

早期感染：有过HIV感染危险行为的个体。处在血清转换的过程，出现