玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种技术规程

DB23/TXXXX—XXXX

玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种技术规程

1范围

本文件规定了玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种的术语和定义、仪器、育种材料及育种程序。

本文件适用于玉米(ZeamaysL.）抗丝黑穗病分子标记辅助育种。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适

用于本文件。

NYT1248.3-2006玉米抗病虫性鉴定技术规范第3部分：玉米抗丝黑穗病鉴定技术规范

NY-T1432-2014玉米品种鉴定技术规程SSR标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

玉米丝黑穗病maizeheadsmut

由丝轴黑粉菌（Sphacelothecareiliana(Kühn)Clint.）侵染所引起的玉米真菌性病害，在7叶期之前

穿透玉米胚芽鞘、中胚轴或根部的表皮细胞完成侵染，初期显症不明显，在开花期破坏雌穗和雄穗的

正常结构，形成黑粉孢子堆积造成绝产。

3.2

标记辅助选择

利用与目标性状紧密连锁的分子标记对目标性状进行选择的育种技术。

3.3

多标记组合

利用与育种目标性状紧密连锁的2个及以上的分子标记组合。

3.4

前景选择标记

用于检测目标性状的分子标记。

3.5

背景选择标记

1

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用于检测试验材料遗传背景的分子标记。

4仪器

4.1DNA提取仪器

研钵、核酸提取磨样机、水浴锅、移液器、低温高速离心机和通风橱等。

4.2PCR检测仪器

PCR仪、移液器、电泳仪、电泳槽和凝胶成像系统。

5育种材料

5.1感病受体亲本

选取农艺性状优良但感或高感丝黑穗病的玉米自交系，且不具有bin2.09主效抗病位点/基因和

bin8.03次主效抗病位点的玉米自交系，作为感病受体亲本（P1）。

5.2抗病供体亲本

选取在田间表现为高抗丝黑穗病，且具有bin2.09主效抗病位点/基因和bin8.03次主效抗病位点的玉

米自交系，作为抗病供体亲本（P2）。

6育种程序

6.1杂交

以P1为母本，以P2为父本，人工授粉杂交，获得F1代杂交种子。

6.2回交

以F1为母本，以P1为父本，人工授粉杂交，获得BC1F1世代杂交种子。

6.3BC1F1基因分型

6.3.1采样

BC1F1世代杂交种子样品可以是种子的胚乳、幼苗的叶片等可用于DNA提取的玉米植物组织。样

品采集后立刻用于DNA提取或冷冻保存。采样时应记录每个体样品名称、样品编号、采样地点和时间

等。

6.3.2DNA提取与纯化

将每个体样品研磨粉末200mg~300mg转入2mL离心管，加入0.5mL2×CTAB提取缓冲液充分

混匀，在55℃～65℃恒浴30min。加入1mL氯仿:异戊醇（24：1），充分摇动5min，8000g，室

温下离心5min。取上清液加入2.5×体积预冷无水乙醇，﹣20℃冰箱放置2h以上，15000g离心20

min。用70%的预冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μL0.1×TE缓冲液溶解，置4℃保存。也可采

用其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法。

2

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6.3.3前景选择

6.3.3.1标记信息

使用的分子标记为玉米抗丝黑穗病bin2.09主效和bin8.03次主效QTL所在位点的连锁标记或抗病基

因的功能标记，详细信息见附录1。

6.3.3.2PCR扩增

采用20μL的反应体系中进行扩增。单标记反应体系包含每种dNTP(2.5mM/mL)2ul，10×Taq

Buffer2ul，25mMMgcl21ul，Primer-F(20u)0.5ul，Primer-R(20u)0.5ul，Taq(5U/uL)1ul，

DNA(20ng/μL~50ng/μL)2ul，ddH2O11ul。扩增反应条件为：PCR程序为95℃预变性5min，1个循

环；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，共34个循环；72℃延伸10min，4℃保存。单标记PCR

产物分别进行酶切，反应体系包括10×NEBuffer1ul，限制性内切酶0.4ul，PCR产物2.5ul，ddH2O

6.1ul，37℃孵育3h左右。

6.3.3.3酶切产物检测

对酶切产物采用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，如个体携带抗病位点或基因，LSdCAP2、

LSdCAP3、LSdCAP8和DNdCAPS8.031标记酶切产物大小分别为93bp，136bp，132bp和137bp，可选取

同时携带4个抗病位点或基因的个体。

6.3.4背景选择

对入选个体进行遗传背景分析，使用的分子标记为简单重复序列（SampleSequenceRepeat，

SSR）标记进行遗传背景，详细信息见NY-T1432-2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》中的附

录C。筛选遗传背景与P1基因型相似度最高的个体。

6.4BC1F1回交

以从6.3中获得的BC1F1为母本，以P1为父本，人工授粉杂交，获得BC2F1杂交种子。

6.5BC2F1基因分型

按照6.3的基因分型方法执行，筛选同时含有4个抗病位点或基因、遗传背景与P1基因型相似度最

高的个体。

6.6BC2F1回交

以从6.5中获得的BC2F1为母本，以P1为父本，人工授粉杂交，获得BC3F1杂交种子。

6.7BC3F1基因分型

按照6.4的基因分型方法执行，筛选同时含有4个抗病位点或基因、遗传背景与P1基因型相似度最

高的个体。

6.8BC3F1回交

从6.7中获得的BC3F1自交，混收，获得BC3F2种子。

6.9BC3F2基因分型

3

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按照6.3的基因分型方法执行，筛选同时含有4个纯合抗病位点或基因、遗传背景与P1基因型相似

度最高的个体。将BC3F2单株种植于田间，选取农艺性状与P1接近的单株。

6.10选系

将6.9中获得的单株进行自交至BC3F4代，从中选择农艺性状与P1相似的材料进行系选，丝黑穗病

抗性鉴定按照NYT1248.3-2006的规定执行，通过小区品比试验，选出优良抗病自交系。

4

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附录1dCAPS分子标记信息

标记信息

序QTL所在的QTL表型贡

标记名称标记类型SNP

号染色体位置献率（%）引物退火温度内切酶酶切位点预期产物大小

位置突变位点

上游TACATTGATATTTGCCACACGAAT5’CTGCAG3’

1LSdCAP2连锁标记2.093655PstI93/73,2069T/C

下游CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA3’GACGTC5’

上游GGCTGCGCCGTGAGATACT5’ACTGGN3’

2LSdCAP3连锁标记2.093655BsrI136/22,11420T/G

下游GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA3’TGACCN5’

上游CGACAACGCCCGCCATCGCCG5’CCGC3’

3LSdCAP8功能标记2.093660AciI132/19,11322C/G

下游TTGAGGTTGCCGAGGTCAGT3’GGCG5’

上游AGCTCAACGCAATTCATTGTGC5’GWGCWC3’

4DNdCAPS8.03-1功能标记8.031065BsiHKAI137/114,2397C/T

下游CGCTCACTGCCAAGTTTTGC3’CWCGWG3’

1

ICS65.020.20

CCSB05

DB23

黑龙江省地方标准

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玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种技术

规程（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

黑龙江省市场监督管理局发布

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1范围

本文件规定了玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种的术语和定义、仪器、育种材料及育种程序。

本文件适用于玉米(ZeamaysL.）抗丝黑穗病分子标记辅助育种。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适

用于本文件。

NYT1248.3-2006玉米抗病虫性鉴定技术规范第3部分：玉米抗丝黑穗病鉴定技术规范

NY-T1432-2014玉米品种鉴定技术规程SSR标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

玉米丝黑穗病maizeheadsmut

由丝轴黑粉菌（Sphacelothecareiliana(Kühn)Clint.）侵染所引起的玉米真菌性病害，在7叶期之前

穿透玉米胚芽鞘、中胚轴或根部的表皮细胞完成侵染，初期显症不明显，在开花期破坏雌穗和雄穗的

正常结构，形成黑粉孢子堆积造成绝产。

3.2

标记辅助选择

利用与目标性状紧密连锁的分子标记对目标性状进行选择的育种技术。

3.3

多标记组合

利用与育种目标性状紧密连锁的2个及以上的分子标记组合。

3.4

前景选择标记

用于检测目标性状的分子标记。

3.5

背景选择标记

1

DB23/TXXXX—XXXX

用于检测试