血液学检验实验指导

血液学检验实验指导

实验一、活化凝血时间测定

【实验原理】同试管法CT测定。试验中加入白陶土-脑磷脂的悬液以充分激活因子刈

和XI,并为凝血反应提供丰富的催化表面，故称为活化凝血时间(ACT)；还可以避免因接触

激活阶段的不同结果带来的影响，从而提高了本试验的敏感性和重复性。

【试剂】

1.脑磷脂的制备脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白

部分后所得的磷脂，故又称部分凝血活酶。取干燥兔脑粉L2g加25ml丙酮，放置2h后过

滤，将此兔脑粉加氯仿25ml,连续震荡2h,以滤纸过滤，滤液蒸发后为淡黄色蜡状物，刮

入玻璃研钵中，加12ml生理盐水研磨成均匀乳剂，以每安瓶0.25ml分装。

2.4%白掏土悬液白陶土2g加入50ml生理盐水中，室温保存，用前摇动。

3.4%白陶土-脑磷脂悬液将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1：50稀释后，再加等量4%白

陶土悬液混合而成。4℃可保存3天，用时充分混合。

4.巴比妥缓冲液巴比妥钠11.75g、NaC114.67g、0.Imol/L的HC1430ml,加蒸馈水

至2000ml。此缓冲液pH应为7.3,否则影响试验稳定性。

【操作方法】

1.在含4%白陶土-脑磷脂悬液0.2ml的试管中注入受检全血0.5,轻轻混匀。

2.其余操作同试管法CT测定。

【参考值】1.70+0.76(1.14~2.05)min»

【临床意义】

1.同试管法CT测定，但较其敏感，重复性也较好，可检出因子VID：C小于45%的亚临

床型血友病。

2.是监测体外循环肝素用量的良好指标之一。

实验二、血浆游离血红蛋白测定(邻一甲联苯胺法)

【实验原理】邻一甲联苯胺在酸性溶液中和过氧化氢与血红蛋白共同作用生成氧化型

联苯胺，产生绿色一蓝色一紫色，其颜色的深浅与血浆游离血红蛋白的含量呈正相关。

【试剂】

1.2g/L邻一甲联苯胺溶液称取邻一甲联苯胺0.2g,溶于冰醋酸601nl，加蒸储水至

100ml,置于棕色瓶内于冰箱保存，色变暗应重配。

2.通过氧化氢溶液用30%过氧化氢原液新鲜配制。

3.10%冰醋酸溶液。取10ml冰醋酸，加蒸偲水至100ml。

4.血红蛋白应用标准液将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成10mg/100ml备用。

5.抗凝试管取0.2ml100U/ml肝素于试管内，在80c以下烘干，每管可抗凝2ml全

血。

【操作方法】

1.将抗凝全血分离血浆。

2.取试管3支，分别标明测定、标准和空白，分别加入血浆、应用标准液，再向

各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各L0ml,充分混匀，放置lOmino

3.于上述3支试管内分别加入10%冰醋酸溶液10ml混匀，用435nm波长比色，以空白

调“0”，读各管吸光度。

4.计算:

测定管吸光度

游离Hb(mg/L)X100

标准管吸光度

【质量控制】

1.一切容器均应避免血红蛋白污染，标本勿溶血，否则可引起假阳性。

2.过氧化氢溶液浓度要准，新鲜配制。

3.联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%,否则均可引起吸光度降低。

4.标准液的加入量一定要准。

【参考区间】＜40mg/L

【临床意义】血浆游离血红蛋白含量增加是血管内溶血的特征。血浆中血红蛋白含量

超过与血清中结合珠蛋白的结合能力时，其含量即可升高。微血管内溶血时，血浆游离血幻：

蛋白含量均明显升高。PNH为200〜2500mg/L,输不合血型后为150〜5000mg/L。温抗体型

自身免疫性溶血性贫血、镰状细胞贫血及地中海贫血时血浆游离血红蛋白可轻度或中度增

加。血管外溶血则正常。

实验三、血清结合珠蛋白测定(比色法)

【实验原理】血清结合珠蛋白(Hp)是肝脏产生的a2糖蛋白，它与游离的血红蛋白

(Hb)具有特殊的亲合力，可形成稳定的Hb-Hp复合物，后者在弱酸性(pH4)条件下，具

有过氧化物酶的活性，测其活性可间接反映Hp的含量。

【试剂】

1.乙酸缓冲液0.2mol/L(pH4)称取乙酸钠(NaAC•3H20)2.8g,冰乙酸5.7ml溶解,

加蒸储水至500mlo

2.0.1%(V/V)愈创木酚溶液取1ml愈创木酚溶液于500ml乙酸缓冲液中，加蒸储

水至1000ml,,

3.0.3%过氧化氢溶液临用前配制。

4.0.5g/L高铁血红蛋白液。

【操作方法】

1.取静脉血分离血清，避免溶血。

2.取受检血清0.4ml,与等量高铁Hb溶液混合。

3.取上述混合液0.2ml,加入于已预温（25℃）的愈创木酚5ml溶液中，再加入0.5ml

0.3%过氧化氢，于25℃水浴内作用8min,注意避光。每份标本均应双份同时测定。

4.用蒸镭水调“0”点，440nm处读取吸光度。

5.由校正曲线查出受检血清中Hp含量。

【质量控制】

1.受检血清要避免溶血。

2.电泳时温度不能过高，应把电泳槽置于冷水中电泳。否则电泳效果差，区带不易区

分。

3.电泳液应经常更换，防止因pH及离子强度改变对电泳效果的影响。

【参考区间】0.2〜1.9gHb/L。

【临床意义】Hp可与Hb结合，以除去血循环中游离的Hb。各种溶血性贫血，无论血

管内溶血还是血管外溶血，血清中即含量均明显降低，甚至测不出。Hp降低的程度与溶血

程度呈正相关，即溶血越严重，血清Hp越低。如果血管内溶血超出Hp的结合能力，即可出

现血红蛋白尿。动态监测表明，急性溶血开始，血循环中游离Hb即迅速增加，随着Hb-Hp

复合物的有效清除，血清Hp也随之恢复正常，因此血清Hp与游离Hb同时测定对溶血性贫

血的诊断及疗效观察均具有重要意义。肝病、传染性单核细胞增多症和先天性无Hp血症，

Hp亦降低，故诊断溶贫时应除外上述疾患。感染、创伤、肿瘤、肝外阻塞性黄疸及类固醇

激素治疗时Hp可增加，这些情况下Hp正常也不能除外溶血。

醋纤膜电泳有助于区别血管内抑或血管外溶血。各种溶血性贫血患者Hp均显著减少，

甚至缺如，故电泳后无HbTIp区带，而仅有一条未结合的11b区带。但显著血管内溶血（如

PNH）时，还出现一条高铁血红素白蛋白区带，而血管外溶血（如球形红细胞增多症）则无

此区带。

实验四、尿含铁血黄素试验（Rou'stest）

【实验原理】含铁血黄素中的高铁离子（Fe“）在酸性环境中与亚铁氟化钾作用，生成

蓝色的低铁氟化铁，称为普鲁氏蓝反应。

【试剂】

1、20g/L亚铁氟化钾水溶液，用时新鲜配制。

2、3%盐酸。

【操作方法】取新鲜尿5ml离心沉淀，弃去上清，于沉淀中加入试剂①和②各1ml,

混匀。置室温lOmin,再离心沉淀，取沉淀物显微镜检查。

【结果判断】如见到有分散或成堆蓝色颗粒(直径约1〜3口m)即为阳性。存在于细

胞内更为可信。

【质量控制】所用试管、玻片、试剂均应防止铁剂污染，否则出现假阳性。每次试验

应做阴性对照。如两种试剂混合后即显深蓝色，提示试剂污染高铁，不宜使用。晨尿阳性率

较高。

【临床意义】血浆游离血红蛋白经肾小球滤出后，被肾小管上皮细胞吸收、降解，最

后形成含铁血黄素，贮存于细胞内。当细胞脱落随尿排出，即成为含铁血黄素尿。正常为阴

性。阳性主要见于慢性血管内溶血，尤其以PNH为多见。即使无血红蛋白尿时也可呈阳性。

但阴性结果也不能完全排除血管内溶血，因含铁血黄素颗粒的直径需＞1Pm时才能从镜下见

到。急性血管内溶血时，虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿，但还不能形成足够大的含铁血

黄素颗粒，需在数日后才阳性，并可持续数周。

实验五、红细胞渗透脆性试验

【实验原理】红细胞在低渗盐水中，水分透过细胞膜内渗，使之膨胀破坏而溶血。本

试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力，以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫

血。红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表面积和体积的比值有关，厚度越大，该比值越小，即

渗透脆性越大；反之，脆性越小。以浓度为横坐标，溶血度为纵坐标绘制曲线，找出50%溶

血对应的盐浓度，即红细胞中间脆性(MCF),后者较敏感。

【试剂】171mmol/LNaCl(10g/L)溶液：将100C烘干的分析纯氯化钠1.0g置于100ml

容量瓶中加少量蒸储水溶解后，再加蒸储水至刻度处。

【操作方法】取12支试管，按5-1分别加入10g/LNaCl和蒸储水。

表5-1红细胞渗透脆性试验操作表(国际单位制)

试管号123456789101112

10g/LNaCl(ml)1.71.61.51.41.31.21.11.00.90.80.70.6

蒸储水(ml)0.80.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.9

NaClSIg/L6.86.46.05.65.24.84.44.03.63.22.82.4

制mmol/L116.3109.4102.695.888.982.175.268.461.654.747.941.0

浓度旧制(%)0.680.640.600.560.520.480.440.400.360.320.280.24

然后各管立即加入新鲜静脉血各1滴并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀，室温静置。

【结果判断】静置室温2h,观察结果，从高浓度开始，上清液呈透明红色而管底有

红细胞者为开始溶血管：溶液透明红色，管底完全无红细胞者为完全溶血管。

【质量控制】

1.NaCl溶液浓度要准确，故应干燥精称。

2.注射器和试管必须清洁干燥。

3.应用新鲜静脉血，忌用抗凝血，必要时可用去纤维蛋白血或肝素抗凝血。

4.结果不易判断时可离心后观察。

5.黄疸病人开始溶血不易观察，严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞

洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。

6.每次试验均应做正常对照，与被检血相差0.4g/L,即有临床意义。

【参考区间】开始溶血：71.8-78.6mmol/L(4.2-4.6g/L)

完全溶血:47.8~54.7mmol/L(2.8-3.2g/L)

中间脆性:68.5—76.2mmol/L

【临床意义】患者比正常对照高6.8mmol/L或中间脆性＞76.2mmol/L有诊断价值。

脆性增加：见于遗传性球形红细胞增多症，也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞

增多者。

脆性降低：见于缺铁性贫血，各型地中海贫血，HbC、D、E病，脾切除术后及阻塞性黄

疸等.

实验六、酸溶血试验(Ham'stest)

【实验原理】正常人红细胞在酸化(pH6.6~6.8)的自身新鲜血清中(内含补体和备

解素)，经37℃孵育lh不溶血。而阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者，因红细胞膜缺陷，

对补体溶血效应敏感性增强，则发生溶血。

【试剂】

1.0.2mol/LHClo

2.8.5g/LNaCl溶液。

【操作方法】

1.配制50%红细胞悬液取10ml离心管2支，标明患者、对照，均加入8.5g/LNaCl

溶液5〜6ml,分别加入患者和对照者未梢血十几滴，混匀，离心后弃去上清，如此重复洗

涤红细胞2次，最后配成50%红细胞悬液备用。

2.分离正常对照血清取与患者同型或AB型血3〜5ml,待自然凝固后分离血清。

3.按表6T操作。

表6-1酸溶血试验操作表

正常对50%红细胞0.2mol/L

管别孵育

照血清悬液(ml)HCl(ml)

患者对照

试验管0.50.0250.0537℃

对照管0.50.0250.05水溶Ih

【结果判断】试验管溶血，对照管不溶血为阳性；试验管和对照管均不溶血为阴性。

【质量控制】

1.血清酸化后试管必须塞紧，否则co?逸出使血清酸度降低。

2.抗凝剂中的Na、K可影响pH,故不宜用抗凝血，但可用脱纤维血。

3.为保证补体充足，最好用混合血清，但正常对照红细胞必须用“0”型血。

4.多次输血者，可因血中异常加细胞相对减少，本试验可呈弱阳性或阴性。

【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH。遗传性球形红细胞增多症及自身免疫性溶

血性贫血也可呈阳性。主要与红细胞球形化有关。血清加热破坏补体，若本试验转为阴性则

更支持PNH。

实验七、蔗糖溶血试验

【实验原理】低离子强度的等渗蔗糖溶液，在温育条件下可促进补体与红细胞膜的

结合，使红细胞对补体损伤的敏感性增强而导致溶血。

【试剂】92.4g/L蔗糖溶液。

【操作方法】取新鲜抗凝血（枸椽酸盐或草酸盐抗凝）0.5ml加入4.5ml蔗糖溶液中，

混匀，置37℃孵育箱内30min后离心，上清液呈红色为阳性，无色为阴性。

【质量控制】注射器、试管应清洁干燥，避免溶血。无蔗糖可用10%葡萄糖代替。

【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH。本试验较Ham试验敏感，是PNH诊断的筛

选试验，但特异性较差。再障-PNH综合征、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血也

可呈阳性。本试验最好与Ham试验同时操作，用正常血清代替患者血清做试验，可除外患者

补体异常所致的假阴性。

实验八、热溶血试验

【实验原理】利用患者的红细胞和自身新鲜血清（含补体），经37℃孵育后，由于葡萄

糖分解产酸，使有内在缺陷的红细胞溶解而溶血。

【操作方法】抽取静脉血取下针头，沿管壁缓缓注入小试管内，避免产生气泡,

置37℃孵育箱保温24h,取出后离心。上清呈红色（溶血）为阳性。

【质量控制】注射器要干燥，小试管要清洁，操作过程中避免溶血，防止出现假阳性。

孵育24h血块未回缩者，可用小玻棒沿管壁轻轻分离，然后离心，观察结果。

【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH,其他溶血性贫血亦呈阳性，但阳性率比PNH

为低。本试验用于PNH的筛选。

实验九、高铁血红蛋白还原试验

一、比色定量法

【实验原理】6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)在戊糖旁路中使6-磷酸葡萄糖转变为6-

磷酸葡萄糖酸，同时催化氧化型辅酶II(NADP)形成还原型辅酶II(NADPH),再使氧化型

谷胱甘肽(GSSG)形成还原型谷胱甘肽(GSH)。NADPH是高铁血红蛋白还原酶的辅酶，在递

氢体美兰和高铁血红蛋白还原酶的作用下，使暗褐色的高铁血红蛋白还原为红色的血红蛋

白。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。

【试剂】

1.12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液亚硝酸钠1.25g,葡萄糖5g,加蒸储水至100ml。

置棕色瓶内4°C下可保存1个月。

2.0.0004niol/L美蓝溶液美蓝15mg放乳钵中，加少量蒸储水研磨后过滤，再加蒸储

水至100ml。室温可保存1〜2个月。

3.0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)取NazHP0"229.5mg,KH2Pol52.2mg,加蒸储水

至100mlo

【操作方法】

1.静脉采血L5-2.0mL加入含有38g/L枸椽酸钠抗凝剂的小瓶内(血:抗凝剂=9:1),

再加葡萄糖20mg摇匀。

2.取血液1.0ml,加亚硝酸钠-葡萄糖溶液和美蓝溶液各0.05ml,颠倒混合12次，使

与空气中的氧充分接触。加塞，37±0.5工水浴(或孵箱)保温3h。

3.取出后摇匀，取0.1ml加于10ml磷酸盐缓冲液中溶解，2min后于波长635nm处(或

红色滤光板)比色，用蒸储水作空白，测其吸光度(A)。

4.另取原血液0.1ml,按上法加缓冲液溶解后比色，测其吸光度(B)o再于此液中加

亚硝酸钠-葡萄糖液1滴，摇匀,5min后比色，测其吸光度(S).

【计算】

A-B

高铁血红蛋白还原率脏(1----------)X100

S-B

【参考区间】高铁血红蛋白还原率＞75%(比色法)

【质量控制】

1.红细胞比积低于30%时，高铁血红蛋白还原率显著降低，必须调整纣细胞与血浆的

比例。

2.本试验抗凝剂若用ACD保养液时，该保养液与血液之比为0.15:1。该抗凝血可保存

1周。因草酸盐具有还原性，不宜使用。

3.标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。

4.测定吸光度时，分光光度计的波长应准确。一般要求S比B大8倍以上。

【临床意义】

本试验用于G6PD缺乏症的过筛检查，蚕豆病和伯氨喳琳型药物溶血性贫血患者，由于

G6PD缺陷（隐性遗传），高铁血红蛋白还原率明显下降。杂合子型多在74%〜31%之间，纯合

子型常在30%以下。

二、细胞化学法

【实验原理】红细胞内血红蛋白可被亚硝酸钠氧化为高铁血红蛋白，后者可经美兰还

原为血红蛋白；G6PD缺乏时则高铁血红蛋白不被还原。加入氟化物后形成氟化高铁血红蛋

白，易被过氧化氢洗脱，染色后形成空影红细胞。正常的红细胞，氧合血红蛋白的过氧化酶

活性，不被氟化物抑制，阻止了枸椽酸盐的洗脱作用，保证红细胞的正常形态。

【试剂】

1.反应试剂取0.0004mol/L美蓝溶液1mL12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液0.5ml,

生理盐水8.5ml,混匀。此液于冰箱中可放置1周。

2.0.4mol/L氟化钠（或氟化钾）。

3.洗脱液95%酒精40.0ml,0.2mol/L枸椽酸8.0ml,30%H@2.5ml,混匀。

4.固定液甲醇

5.染液5g/L苏木素液，4g/L伊红液。

【操作方法】

1.取ACD抗凝血0.05ml,置于预先盛有0.05ml反应试剂之小试管中，摇匀，放37c

水浴（或孵箱）中保存4h。

2.取出后用滴管轻轻吸去上清液，于剩下的红细胞中加入0.4mol/L氟化钠0.005ml（细

破棒蘸起一小滴），摇匀。

3.5min后加入1滴患者血浆（或AB型血浆），用滴管混匀，取出1滴作薄涂片，待干。

4.将玻片放入盛有洗脱液的染色缸内，上下移动Imin,再静置于液中2〜4min,取出

后甲醇固定半分钟，水冲洗，待干。

5.用苏木素染2〜3min,水冲洗，再以伊红染l~4min水冲洗，待干。

6.在高倍镜下观察，计数1000个红细胞（涂片四角及中央各数200个），算出G6PD

缺乏红细胞（空影红细胞）的百分率。

【质量控制】本法受洗脱液HQ2浓度的影响，因压。2易分解，不易保存所需浓度，因

此使用过程中宜随时补充少量上。2。补充的量依使用次数的多少、放置时间和室温高低而定，

需凭经验掌握，最好用阴性、阳性样本对比试验来确定。

【临床意义】正常人空影红细胞＜0.4%,G6PD严重缺乏者＞88.0%,杂合子0.4%~88%»

此法对于杂合子的检出敏感性较高，但作为筛选法则过于繁琐。

实验十、变性球蛋白小体检查

【实验原理】氧化物质可使G6PD缺乏患者的红细胞中积蓄多量的H2O2等氧化剂，使

血红蛋白氧化变性。而与某些碱性染料（如煌焦油蓝）或结晶紫孵育后形成蓝黑色或紫黑色

颗粒定位于红细胞内。

【试剂】用0.73%NaCl溶液配制成1%的结晶紫（龙胆紫）溶液。

【操作方法】滴1滴试剂于载玻片上，用玻棒或竹签蘸一点患者血液于其上，混匀，

加盖玻片，染5~10min后在高倍镜下观察。计算500个红细胞中含变性珠蛋白小体红细胞

的百分率。

含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞中出现多个紫黑色、或细或粗、形状不规则的颗

粒，位于细胞的边缘或中央，血红蛋白或仍均匀分布，或完全缺如。

【参考区间】正常人无变性珠蛋白小体，或偶见几个（＜0.01）细小者。

【临床意义】阳性见于G6PD缺乏症患者（3%〜82%）,随着溶血的恢复逐渐减少或消

失。还见于不稳定血红蛋白病，呈单一的圆形或卵圆形粗大颗粒，附着于红细胞膜或突出于

其外。另外，硝基苯、苯胺、苯朋等化学物质中毒者也可出现变性珠蛋白小体。

实验十一、葡萄糖6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验

【实验原理】在葡萄糖-6-磷酸（G6P）和NADP存在下，G6PD能使NADP还原成NADPII,

后者在紫外线照射下可发出荧光。

【试剂】混合剂的成分与配方如下：

0.Imol/LG6Plml

7.5mmol/LNADP1ml

0.7mol/LTris-HCl（pH7.8）3m1

8mmol/L氧化型谷胱甘肽1ml

lOg/L皂素2ml

蒸储水2ml

此混合试剂分装，置-20”C保存，可稳定数月。

【操作方法】

1.取末梢血或抗凝血5〜10u1,加入含100口1反应试剂的小试管中。亦可取血滴于

滤纸上,干后取直径约为1cm的血迹剪碎,置含反应试剂的小试管中洗脱。

2.放37℃孵育lOmin。

3.取约10lU溶血液滴于新华滤纸上，晾干后立即用冷风吹干，在长波紫外线下观察

结果。

【结果观察】G6PD正常者可见明亮荧光，严重缺乏者无荧光，杂合子介于两者之间

（弱荧光）。

【质量控制】

1.本法是直接测定NADPH的量，特异性较好。

2.每次或每批要有（G6PD）正常和缺陷者的标本作对照。

3.取血量以5〜10u1为宜，正常者宜偏少，贫血者可偏多。

4.干血滤纸片存在其酶活性可损失，宜同时作正常对照血样品。

5.加入GSSG是为了提高敏感性，因有残余G6PD活性的标本（如杂合子），可产生少量

NADPH,若有足量的GSSG存在，则通过谷胱甘肽还原能的作用，再将其氧化为NADP。这样

患者和正常红细胞即可显示明显差别。不使用GSSG亦可，效果稍差，可将G6P-N@和NADP

浓度减半，血样本用生理盐水稀释至1/4,孵育时间缩至3min,可减弱残余酶活性的影响。

【临床意义】正常人有很强的荧光。G6PD缺乏者荧光很弱或无荧光；杂合子型或某

些G6PD变异体者可有轻度或中度荧光，本试验适用于大批量筛选，但不利于杂合子型的检

出。

实验十二、硝基四氮哩蓝试验

硝基四氯哇蓝试验（nitroblue-tetrazoliumtest）有定性试验和G6PD活性定量测定两

种。

一、定性纸片法

【实验原理】NADPH通过吩嗪二甲酯硫酸盐（M-PMS）的递氢作用，使淡黄色的硝基

四氮唾蓝（NBT）,还原成紫色的甲。G6PD缺乏时由于NADPH生成不足，不显紫色。

【试剂】

1.0.25mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）称取三羟甲基教基甲烷（Tris）7.6g,溶

于蒸储水约100ml中,先加入lmol/HCl60mL然后用pH计调整pH至7.4,再加蒸储水200m1。

在4℃可保存数月。

2.0.6g/LM-PMSM-PMS6mg加蒸储水10ml溶解，加入0.01mol/LHC11小滴调整pH

至3.8左右。于棕色瓶内，暗处存放，可保存2周以上。如试剂由黄变绿，应重新配制。

3.3g/LNBTNBT15mg加蒸储水5ml,在水浴中加热至80K左右溶解,过滤。用棕色瓶

盛装，可保存2周以上。

4.6.25mmol/LG6P-Na2称取G6P-Na210mg,用Tris-HCl缓冲液4ml溶解。放0℃可保

存1个月以上。

5.6.25mmol/LNADP称取NADP10mg（如用含70%的制品则称14mg）,加Tris-HCl缓冲

液2ml溶解。放0"C可保存数月。

6.0.12mol/LMgCL称取分析纯MgCl2•6H202.10g溶于蒸储水至100mLMg?'为G6PD

的激活剂。

7.反应试剂M-PMS0.1ml,NBT0.5ml,G6P-Na20.4ml,NADP0.1ml,MgCb0.1ml,

混合，当天配制。

8.对照试剂用等量Tris-HCl代替G6P-NaZ和NADP,余同反应试剂。

【操作方法】

1.取末梢血1滴，滴于干净滤纸上，血迹直径1.0cm左右，自然晾干（密封后4"C保

存，酶活性可维持5〜7天）

2.用打孔机打出一小圆血迹红片（直径约5mm）,置于反应板的小孔内，加入蒸镭水1

滴摇匀，静置5min,待红细胞完全溶解。

3.用6号半至7号注射针头吸取反应试剂，在每个放置血纸片的小孔中央加入1滴，

轻轻混匀。加盖，置37"C水浴箱中温育10〜30min。以对照试剂取代反应试剂作对照。

【结果观察】正常酶活性者纸片变为紫蓝色；酶严重缺乏者仍为红色；杂合子为淡紫

红色。观察时与对照孔比较看颜色的区别。

【质量控制】

1.血迹纸片放置时间长短对结果观察为重要。如为新鲜血纸片，37"C5〜lOmin能看

到结果，若放置数小时，则20〜30nlin才现结果，故应在同一批标本相互比较。

2.缓冲液的pH要准确。

3.遇到酶缺乏或可疑标本，应用定量法来确证。

二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性定量测定

【实验原理】与定性纸片法相同。NADPH生成的量与甲生成的量在一定范围内呈线

性关系，在分光光计波长650nm测定甲的吸光度，可反映NADPH生成的量，用以代表G6PD

活性。

【试剂】

1.反应试剂对照试剂及其各种组成液均与定性纸片法相同。

2.7mol/L尿素称取分析纯尿素210g,溶于蒸储水至500ml（可微热溶解），室温保

存。

3.氯化高铁血红蛋白测定法试剂（Drabkin）NaHC03l.Og,K3Fe（CN）60.2g,KCNO.05g,

加蒸储水至1000ml,置棕色瓶内暗处保存。

【操作方法】

1.取抗凝血（肝素或EDTA血需在12h内测定，ACD血在0〜4（可保存至3天）0.1ml,

用生理盐水洗涤红细胞3次（2000r/min）,吸去上清液及白色层（为血小板及白细胞，如不

吸去则结果增高）。

2.红细胞悬液内加入蒸镭水3〜4ml,（一般视其颜色深浅而定），使其溶血，混匀，静

置lOmirio

3.取0.4ml溶血液，加入4.0mlDrabkin试剂,放置15min,用Drabkin试剂作空白,

光径1cm,于540nm波长读取吸光度（H）»

4.另取2只试管，每管准确加入溶血液0.1ml于管底。

5.于第一管中加对照试剂0.1ml,摇匀，放入37t0.5"C水浴中保温，并立即用秒表记

录时间。于第二管中加入反应试剂0.1ml,摇匀，待秒表行至30s时，放入水浴中保温。

6.准确30min取出第一管，立即加入7moi/L尿素2.5ml,以终止反应。30s钟后取出

第二管加入尿素2.5ml»

7.用分光光度计比色，光径1cm,波长650nm,以第一管为空白，测定第二管吸光度（S）。

【计算】以每克Hb每分钟吸光度变化值作为单位，即NBT单位（U）=AA/min/Hb（g）。

0.1ml溶血液中含Hb（g）

644584.411

=0.1XHXXXX

440.410001000

=HX0.00161

S1s

G6PD（U）="X=—X20.7

HXO.0016130H

【参考区间】：6.7~20.5U

中间缺乏值（杂合子）：1.7〜6.6U。

严重缺乏值：低于L6U。

【质量控制】

1.试剂配制必须严格按照操作规程。反应试剂配制后放置24h,显色反应明显降低。

2.标本如不能及时测定，应保存于冰箱（0〜4°C）。洗涤后的红细胞，特别是溶血液不

能久置（4℃不能超过4h）。

3.缓冲液的pH,保温温度、时间及加入溶血液量都必须十分准确。

4.尿素的作用是终止酶促反应，并保持色泽澄明度。加尿素后应尽快比色（不超过lh）。

5.由于甲溶解度低，溶血浓度不宜过高，一般以吸光度0.300〜0.400为宜。

6.由于使用的NBT不同，各实验室最好建立自己的参考值。

7.Hb测定必须准确，应用HICN标准液校正所有仪器，测得的H值应先乘以校正系数

然后带入计算公式。

实验十三、丙酮酸激酶（PK）荧光斑点试验

【实验原理】由PK产生的丙酮酸作用于LDH,使其转变为乳酸，同时NADH转变为NAD\

在长波紫外线照射下NADH有荧光，NAD*无荧光，故反应后荧光逐渐消失。

【试剂】

1.0.15mol/LPEP249mgPEP溶于蒸储水5ml中，0.2mol/LNaOH调整pH至7〜8。

2.0.03mol/LADPADP二钠盐150mg溶于蒸镭水5ml中，用0.2mol/LNaOH调整pH7~

8。

3.0.08mol/LMgSO4MgSO4•7H2098mg溶于蒸储水5m1中。

4.0.25mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）取KILPO,3.40g,K2HPO<4.35g,分别配成100ml»

然后取KH2Pol溶液19.2ml,K2HPO1溶液80.8ml混合，校准pH7.4。

5.反应试剂PEP30u1,ADP100ul,MgSOi100ub磷酸盐缓冲液50u1,蒸储水

720y1,混合。在4°C保存1周，临用时加NADH干粉Img,混匀。

【操作方法】

1.取抗凝血（肝素、EDTA或ACD）经1000r/min离心沉淀5min,将血浆及白细胞小心

吸弃。

2.用冷生理盐水洗红细胞3次，最后用冷生理盐水配成20%红细胞悬液。

3.于小试管中加200U1反应试剂,再加红细胞悬液20U1,混匀,置37℃水浴中反

应。

4.在反应开始、10、20、25、30和60nlin各取此液，点在新华滤纸上，晾至完全干燥,

在长波紫外线下观察荧光点。

【结果观察】PK活性正常者荧光在20min消失，中间缺乏者（杂合子）荧光在25〜

60min消失，严重缺乏者（纯合子）荧光60min不消失。

【质量控制】

1.每次试验都应用正常人血液作阴性对照。

2.白细胞和血小板中含有与红细胞中类型不同而活性很高的PK同工酶，而且在PK缺

乏症其活性也不降低，故血液离心后应尽量除去白细胞和血小板。

3.本法不用皂素而用低渗反应试剂来破坏红细胞，这样可使由残存白细胞和血小板中

释放出的酶量很少，不影响试验的可靠性。

【临床意义】正常人本试验为阴性，即荧光逐渐消失。丙酮酸激的缺乏症患者呈阳性

（荧光不消失），可用于丙酮酸激酶缺乏症的过筛试验。

实验十四、丙酮酸激酶活力测定

【实验原理】

在ADP存在下，丙酮酸激酶（PK）使磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转变为丙酮酸，后者通

过乳酸脱氢能（LDH）作用转变为乳酸，同时NADH转变为NAD'。NADH在340nm处有吸收峰,

故可根据吸光度的改变来推算PK的活力。

【试剂】

1.0.3mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）:取Tris3.63g,KCl1.679g,MgSO,-7H200.592g

溶于90ml蒸储水中，用0.Imol/LHCl调节至pH7.4,加水至100ml,每管5ml分装，于-20

"C保存。

2.ADP溶液：取ADP二钠盐6.5mg,溶于1ml蒸储水中，宜少量配制，置4"C备用。

3.5mmol/LNADH溶液：取NADH3.5mg溶于1ml蒸储水中，宜少量配制，备用。

4.LDH溶液：自兔肌肉提取之悬液，活力单位为600U/ml。

5.30mmol/LPEP溶液：称取磷酸烯醉式丙酮酸锈盐14.43mg,溶于1ml蒸储水中，用

前宜少量配制，置4°C备用。

【操作方法】

1.取肝素或£口丁人抗凝血3.51111,加1ml60g/L右旋糖酎，室温（20℃）静置30min后

吸弃上层含有白细胞的血浆。

2.再加1ml右旋糖酊，并用生理盐水补足4.5ml,重复6次，然后把几乎无白细胞的

红细胞用生理盐水洗2次。

3.取洗过的红细胞经压积为80%〜90%的悬液，吸0.1ml,加入41nl蒸储水中，使其溶

血。溶血液置冰浴中备用。

4.410mm光径的比色杯中依次加入Tris缓冲液1.00ml,H2O1.48mLNADH溶液0.10ml,

ADP溶液0.10ml,LDH溶液0.02ml,PEP溶液0.20mL总容量2.90ml,37"保温。

5.分光光度计340nm,37"C在测定管加入0.1ml溶血液后，立即计时，用蒸储水调零,

每分钟测吸光度1次，共测15min。

6.根据读数记录，在线性反应期算出平均吸光度下降值A4/min,再按下式计算。

【计算】

PK活性（U/ml红细胞）

A4/min4.13.01

=XXX

6.220.10.1PCV

（6.22=NADH的毫摩尔吸光系数）

【参考区间】

1.2~2.2U/ml红细胞（37℃）

【质量控制】

1.血液标本需新鲜，若以4"C贮存血进行测定，则须有同样贮存血的正常对照。

2.血细胞含有相当高PK活性，即使在红细胞PK缺乏症亦是如此。故必须尽可能从红

细胞悬液中除去。

【临床意义】红细胞丙酮酸激酶缺乏症为常见的先天性非球形细胞溶血性贫血，属常

染色体隐性遗传。纯合子时，PK活性显著降低；杂合子时，无贫血症状，但酶活性降低，

介于正常人和纯合子之间。

实验十五、自身溶血试验及纠正试验

【实验原理】将肝素抗凝血置37℃孵育48h,观察自然溶血程度，并结合加葡萄糖及

ATP纠正试验，协助遗传性球形红细胞增多症的诊断，并鉴定其类型。

【试剂】

1.10%葡萄糖（无菌）。

2,等渗盐水（无菌）。

3.0.4mol/LATP生理盐水无菌液。

4.0.4g/L氨水（浓氨水0.16ml加水至100ml）或HiCN转化液。

【操作方法】

1.取小试管4支，分别加lg/L肝素0.02ml,3.624kg(8磅)15min高压灭菌,烘干。

2.取静脉血4ml,以无菌手续按表15-1加入各管，混合抗凝，然后依次操作。

3.以冷藏血离心后的血浆0.2ml加0.4g/L氨水或转化液4.8ml为空白对照管，在540nm

处测各管吸光度A值。

4.计算各管溶血率(相当于空白对照管100%的比值)。

测定管AX(1-红细胞压积)

测定管溶血率=

溶血对照管AX4

【质量控制】操作过程严格无菌。

【临床意义】正常人血液无菌时孵育48h后溶血率很低，一般<4.0缸加葡萄糖或ATP

后，溶血率更低(<0.6%),而各类溶血性贫血溶血率不同程度增强。遗传性球形红细胞增多

症自身溶血早而明显，能被葡萄糖纠正。遗传性非球形红细胞溶血性贫血，自身溶血增加，

其中1型因6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性降低，能被葡萄糖和ATP纠正；II型

表15T自身溶血试验操作表

123溶血对照

肝素抗凝血(ml)1.01.01.(1.0

10%葡萄糖(ml)0.05—一—

0.4mol/LATP(ml)0.05一—

9g/LNaCl(ml)—一0.(5一

370C孵育48小时测红细胞压积冷藏

孵育血浆(ml)0.20.20.2全血0.1

0.4g/L氨水或

4.84.84.89.9

HiCN转化液(ml)

系丙酮酸激酶缺乏，溶血不能被葡萄糖纠正，但能被ATP纠正。PNH、自身免疫性溶血性贫

血.、药物性溶血等均不能被葡萄糖纠正。大部分不稳定血红蛋白病例自身溶血率轻度增加，

加葡萄糖1型可以纠正，II型则不能纠正。

实验十六、血红蛋白电泳

【实验原理】利用各种血红蛋白(包括正常或异常Hb)珠蛋白及等电点不同，在一定

电场和pH缓冲液中电泳方向和速度亦不相同，Hb与等电点缓冲液的pH差别越大，Hb电泳

速度越快；相反则电泳速度越慢。采用不同的缓冲液，支持介质和电泳仪其分辨率不同。以

此来判断异常Hb的性质，为诊断异常Hb病提供依据。

在电泳中，因所用支持物不同，而有纸上电泳、琼脂电泳、淀粉胶电泳、醋酸纤维素薄

膜电泳等。电泳胶分辨率较高，但制板较费时且不方便，琼脂凝胶电泳应用于某些异常11b

的分辨。醋酸纤维素膜电泳方法简便，省时，易于洗脱定量，对异常Hb分辨率较好，适于

一般试验室作为异常Hb的筛选试验。在缓冲液选择上，多以碱性（pH8.5或9.1）缓冲液浸

泡薄膜，用硼酸盐缓冲液进行电泳筛选。必要时再用川6〜6.2缓冲液电泳鉴别。

【试剂】

1.0.26mol/LTris缓冲液（pH9.1）（用于阳极）三羟甲基氨基甲烷25.2g,EDTA2.5g

或EDTA-Na?2.83g,硼酸1.9g,加蒸储水至1000ml。

2.巴比妥缓冲液（pH8.6）（阴极）巴比妥钠5.15g,巴比妥0.92g,加蒸储水至1000ml。

3.醋酸纤维素薄膜浸泡液①、②两种缓冲液等量混合。

4.氨基黑10B染色液氨基黑10B1g,磺基水杨酸10g,冰醋酸20ml,加蒸储水至400ml。

5.漂洗液乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸储水50ml混合。

6.透明液冰醋酸25ml,无水乙醇75ml。

7.0.4mol/LNaOHo

[Hb液的制备】将抗凝血离心去血浆，加生理盐水洗涤3次。每ml红细胞加1.4ml

蒸储水和0.4ml四氯化碳，强烈振摇5min,离心后取上清液于4℃冰箱保存备用（不适用于

不稳定血红蛋白检查）。

【操作方法】

1.电泳槽内阳极注入pH9.1的Tris缓冲液；阴极注入pH8.6的巴比妥缓冲液，要求两

极液面平行。

2.醋酸纤维素薄膜切成12X4cm的条状，置于浸泡液内lOmin后取出，用滤纸吸去多

余液体，使粗面朝上，贴于电泳槽的支架上，用两层纱布搭桥，自然平衡5min。

3.用Hb吸管吸取2〜3u110%Hb液，放在盖玻片上（长约1cm）边缘，使之印在靠阴

极端1.5cm薄膜片处，薄膜下衬一张干燥滤纸以吸去多余的Hb液，同时用正常人血红蛋白

液做对照。

4.接通电源，平衡5min后，调电压至150v,电流0.2mA/cm薄膜宽，电泳15〜30min。

取下薄膜条，置于氨基黑10B染液中，lOmin后取出，用漂洗液至薄膜条洁白为止。

5.定量测定将各小区带剪下,llbAi用20ml0.4mol/LNaOH脱色,HbA2用4ml0.4mol/L

NaOH脱色。另取一条无色膜条（与Hb条带相仿大小）,加0.4mol/LNaOH液4ml作为空白，

用分光光度计，在640nm处比色，记录吸光度，按下式求其含量（%）«

Hb-吸光度

HbA2（%）=X100

HbA?吸光度+HbAi吸光度X5

【质量控制】

1.醋酸纤维素薄膜应在浸膜液中浸透。

2.防止被检血红蛋白以外的标本污染薄膜。

3.为保证电泳效果，电泳槽内缓冲液最多使用两次。

【参考区间】1.1%~3.2%.

【临床意义】

HbA2增高是轻型地中海贫血的重要特征。止匕外，巨幼红细胞性贫血.，恶性贫血.，某些不

稳定血红蛋白等，HbA?也相对增高。在电泳分组中，以HbA为标志，较HbA快者包括H组和

J组，属快速异常Hb

HbA,减低见于缺铁性贫血及铁粒幼红细胞性贫血等。

实验十七、抗碱血红蛋白（HbF）测定

【实验原理】抗碱血红蛋白具有抗碱变性的能力，在碱性溶液中不易变性沉淀，其他

Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀，测其滤液中Hb含量即HbF的含量。

【试剂】

1.0.083mol/LKOH4℃保存，用前应滴定校正。若有沉淀或混浊应弃去。

2.半饱和硫酸铁取饱和硫酸铉（约390g/500ml）4ml,加蒸储水4ml及lmol/L盐酸

0.2ml。

【操作方法】

1.Hb液的制备取抗凝血1〜2ml