DNA的生物合成(基因信息传递)

DNA的生物合成复制(replication)

是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA本章主要内容：

复制的基本规律

DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的过程逆转录和其他复制方式

DNA损伤（突变）与修复复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第一节复制的方式—半保留复制

(semi-conservativereplication)双向复制

(bidirectionalreplication)半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)

复制的基本规律(重点)

一、DNA复制的基本特征：半保留复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自为模板合成与模板互补的子链。子代DNA，一股单链来自亲代，另一股单链从新合成，这种复制方式称为半保留复制。

全保留式半保留式混合式DNA复制的3种可能方式密度梯度实验支持半保留复制机制15NH4Cl14NH4Cl含重氮-DNA的细菌第一代第二代AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制叉子代DNA子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、DNA复制从起始点向两个方向延伸A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个复制起始点。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’三、半不连续复制3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)领头链：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的随从链：复制的方向与解链方向相反，不连续复制岡崎片段(okazakifragment)DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication参与DNA复制的物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。一、生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPiDNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase，DNA-pol)活性：1.5

3

的聚合活性①3

5

外切酶活性:②5

3

外切酶活性:能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解2.核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

323个氨基酸604个氨基酸DNA-polⅠ功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅡDNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。DNA-polⅢ是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。（二）常见的真核细胞DNA聚合酶三、复制保真性的酶学依据遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的即时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：（一）核酸外切酶活性核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。（二）碱基的正确选择DNA聚合酶协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。四、复制中DNA解链伴有分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解螺旋酶(helicase)：利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)：复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)：在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。E.Coli基因图谱（二）DNA拓扑异构酶理顺DNA链复制过程中正超螺旋的形成，需拓扑异构酶水解并连接磷酸二酯键。

拓扑异构酶分类：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。拓扑酶的作用方式：五、DNA连接酶连接单链缺口连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶功能：提供核糖3

-OH提供5

-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3

,5

-磷酸二酯键生成的比较

DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制起始：DNA解链形成引发体需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。（二）半不连续复制复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：沿5

→3

方向连续延伸随从链的合成领头链连续复制，随从链不连续复制领头链和随从链由同一种DNA-pol催化延长复制过程简图原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接：哺乳动物细胞周期DNA合成期二、真核生物的DNA生物合成细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。

复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物复制的起始与原核基本相似增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindependentkinase，CDK)。

CDK相匹配的周期蛋白作用点CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1→S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2→M期哺乳类动物的周期蛋白和CDK哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(checkpoint)蛋白。DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体真核生物复制叉的延长：（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题端粒（Telomeres）：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构

富含GC的重复序列人：(TTAGGG)n功能：维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒酶：RNA--蛋白质复合物既有模板，又有逆转录酶以自身的RNA为模板延长DNA单链，然后反折为双链,爬行模式端粒酶与生物体的衰老、肿瘤的发生有关聚合酶基本性质相同复制过程基本相同半保留复制、半不连续复制、双向复制原核、真核生物DNA复制的异同相同点真核生物多复制起点全部复制后才可开始下一次复制酶和蛋白因子不同

末端需端粒和端粒酶原核生物1个复制起；起点可连续发生复制酶和蛋白因子不同逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四节某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。一、逆转录病毒的基因组的复制逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNADNA聚合酶双链DNARNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组整合到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆转录酶

AAAA

TTTTAAAA

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录现象说明：在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。三、噬菌体和线粒体DNA的复制噬菌体：滚环方式复制线粒体DNA：D环方式复制特点：复制起始点不在同一位点，内、外环复制有时序差别。复制中呈字母D形状。

D-环复制时需合成引物。第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)&Repair第五节DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化的分子基础（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性有些突变没有可察觉的表型改变，如在简并密码子上第三位碱基的改变，非编码区上序列变化等。（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡

（四）突变是某些疾病的发病基础二、多种化学或物理因素可诱发突变大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。致突变的因素，主要有物理和化学因素。物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射UV化学因素：三、突变的类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rear