第八章-免疫学应用(二)

第八章免疫学的临床应用（二）免疫预防免疫治疗免疫诊断免疫学诊断一、抗原或抗体的检测二、淋巴细胞的测定免疫学诊断（一）抗原抗体反应的原理免疫学诊断一、抗原或抗体的检测1、抗原抗体反应的特异性（1）特异性：基于两种分子间的结构互补性和亲和性。（2）可逆性（3）适宜的条件：电解质、pH、温度等2、抗原抗体反应的可见性抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象。应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等2、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂（二）抗原或抗体的检测方法凝集反应沉淀反应免疫标记技术

（一）凝集反应（agglutination）

颗粒性抗原（红细胞、细菌、乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。1、直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、试管凝集2、间接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。3、抗球蛋白试验（Coomb)乳胶颗粒红细胞类风湿因子检测妊娠试验间接凝集直接凝集（二）沉淀反应（precipitation）

可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。可分为单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫比浊法等。免疫比浊法：快速简便。用于血清IgG、IgA、IgM、补体C3、C4含量测定

用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）

（三）免疫标记技术液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）直接荧光法间接荧光法免疫荧光技术间接法双抗夹心法竞争法E:辣根过氧化酶HRPS:底物二氨基联苯胺DAB/邻苯胺酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA法）间接法DAB双抗夹心法DABBAS-ELISA法（

biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系统-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。卵白及某些微生物中的蛋白质

灵敏度达pg水平。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及IgE等。放射免疫检测法（RIA）竞争法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。免疫印迹法胶体金斑点免疫层析试验

抗HCG免疫金复合物干片粘贴在近下端C处，抗HCG单克隆抗体和抗小鼠IgG抗体分别固化于醋酸纤维素膜的检测区T处和对照区R处。当试纸条下端B处浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体液体向上端移动，流经干片C处时，使免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有HCG，可与C处抗HCG免疫金复合物结合。此抗原抗体复合物流至测试区时即被固相抗体所获，在T处显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控参照区R处与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而呈现出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。胶体金斑点免疫层析试验原理操作及结果判定

二、淋巴细胞的测定（一）淋巴细胞的分离与类型鉴定1、淋巴细胞的分离：外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法白膜层单核细胞淋巴细胞BT吸附分离过尼龙毛柱分离（1）间接免疫荧光法：鉴定细胞的群、亚群。用CD3、CD4、CD8单克隆抗体检测患者外周血T细胞表面相应抗原CD3+——T细胞，计算T细胞总数。

CD4+——CD4+T细胞，计算CD4+T细胞数。

CD8+——CD8+T细胞，计算CD8+亚群T细胞数

计算CD4+/CD8+比例

正常人PMB中T细胞占65~75%CD4+

/CD8+约为1.5~22、淋巴细胞的类型鉴定：淋巴细胞表面标记检测、记数用mIgM、mIgD单克隆抗体检测患者外周血B细胞表面相应的抗原已检测B细胞的数量正常人外周血中SmIg+

细胞占8~12%（2）流式细胞术（flowcytometry）

（二）淋巴细胞功能测定1、T细胞功能测定（1）T细胞增殖试验（淋转）：丝裂原、抗CD3单克隆抗体等能非特异地激活T细胞，使之发生转化增殖，计算淋巴母细胞转化率（正常值65~80%）。①形态学观察法②3H-TdR渗入法：用液体闪烁仪测定样品的β射线放射活性③MTT法（2）淋巴细胞介导的细胞毒试验（LMC）

——检测CTL、NK、LAK、TIL细胞杀伤靶细胞的功能淋巴细胞转化实验T细胞PHA淋巴母细胞（体积增大，形态不整齐，核大，松散，有核仁，胞浆变宽，出现空泡）刀豆素A(ConA）美洲商陆（PWM）

分型：小淋巴细胞：核质密、胞浆小、无核仁过渡型：比小淋巴细胞略大、核质略疏松，出现核仁淋巴母细胞：大4～5倍，核质疏松，核仁1～3个，核周淡染的透明区，胞浆网状可见空泡分裂相：染色体型方法：外周血+PHA→混匀，37℃72小时→取培养液涂片染色、镜检，分别计数转化细胞（淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞）和成熟的淋巴细胞，共计数200个细胞。并计算转化率。转化率﹦转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数×100%正常成人转化率为：60%~80%，﹤50%视为降低E玫瑰花环实验

（Erythocyte)TcellCD2（SRBCreceptor）结果判断及意义结果判断：围绕≥3个绵羊红细胞为阳性E花环形成率=正常值：40%-70%意义：反映T细胞的数量E花环形成阳性+E花环形成