免疫学检测技术及其应用

免疫学检测技术及其应用第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素一、抗原-抗体反应的特点及检测原则特点：1.高度特异性2.表面化学基团之间的可逆结合3.适宜的抗原抗体浓度和比例4.抗原抗体反应的两个阶段：

1）抗原抗体特异性结合阶段

2）可见反应阶段2021/1/52一、抗原-抗体反应的特点1、高度特异性：抗原表位与抗体分子CDR的互补结合是抗原-抗体反应的化学本质。2021/1/532、表面化学基团的可逆性抗原与相应抗体除空间构型具有互补性外，两者主要是通过分子表面的氢键、疏水键、静电和范德华力非共价结合。亲合力（avidity）:

指抗体分子的抗原结合部位与抗原表位之间的结合强度2021/1/54在一定浓度范围内，二者比例合适，可出现肉眼可见的反应物；若比例不合适，即抗原或抗体过剩时，可形成小分子抗原-抗体复合物。此种小分子复合物多呈游离状态，不能为肉眼所见。

3、适宜的抗原抗体浓度和比例2021/1/554、抗原-抗体反应的两个阶段①抗原-抗体特异性结合阶段：特点：反应快，数秒钟至几分钟内完成。

②反应可见阶段：特点：所需时间较长，从数分钟、数小时到数日不等，且受电解质、温度和酸碱度等因素影响。2021/1/561.电解质：在电解质作用下，抗原-抗体复合物失去较多负电荷，使彼此连接出现肉眼可见的凝集或沉淀现象。试验中常用0.85%的NaCl溶液作为稀释液，提供适当浓度的电解质。二、抗原-抗体反应的影响因素

2021/1/57提高浓度可增加抗原与抗体分子碰撞机会，加速抗原-抗体复合物的形成。通常抗原-抗体反应的最适温度是37℃。2.温度3.酸碱度

抗原-抗体反应的最适pH值在6-8之间。pH过高或过低，均可影响抗原或抗体的理化性状，影响试验的可靠性。

2021/1/58三、抗原-抗体反应类型和检测方法1.凝集反应2.沉淀反应3.免疫标记技术根据抗原的性质、参与反应的成分和反应呈现的结果，将抗原-抗体反应分为四类：2021/1/59（一）凝集反应直接凝集：玻片法、试管法间接凝集间接乳胶凝集：ASO试验、RF试验间接血球凝集：间接凝集抑制试验：免疫妊娠试验Coombs试验：直接法、间接法2021/1/510（一）凝集反应：概念：细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集现象。类型：2021/1/5111、直接凝集反应（directagglutination）概念：颗粒性抗原直接与相应抗体结合出现的凝集现象。检测方法：（1）玻片法：特点定性试验；用已知抗体检测未知抗原；本法简捷快速；2021/1/512（2）试管法：特点半定量试验；用已知抗原检测未知抗体的相对含量。应用肥达反应——伤寒或副伤寒；外斐氏反应——立克次体病瑞特反应——布氏菌病2021/1/5132、间接凝集反应（indirectagglutination）概念：将已知可溶性抗原或抗体与免疫无关的载体颗粒结合形成致敏颗粒后，再与相应抗体或抗原进行反应出现的凝集现象。

应用抗链“O”试验（ASO）——风湿病类风湿因子测定（RF试验）——类风湿性关节炎（RA）2021/1/5142、沉淀反应速率散射比浊/免疫比浊琼脂扩散单向琼脂扩散双向琼脂扩散免疫电泳技术免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳2021/1/515特点：定量试验；敏感性较高。应用：测定血清中IgG、IgM、IgA等含量和C3、C4等补体含量（1）单向琼脂扩散试验（singleagardiffusion）2021/1/516单项琼脂扩散试验：

定量测定血清中IgG、M、A和单一补体含量方法与原理2021/1/5172、双向琼脂扩散试验（doubleagardiffusion

）应用（1）定性试验：①鉴定可溶性抗原和抗体。②分析复杂抗原成分和抗体（2）半定量试验：免疫血清稀释后进行的血清效价测定。2021/1/5182021/1/519优点：敏感性同单扩散；所需时间短。应用：快速测定标本中可溶性抗原的含量。4火箭电泳（rocketelectrophoresis）

又称电泳免疫扩散2021/1/520免疫荧光技术免疫组化技术免疫印迹技术—Westernblotting法免疫层析技术—金标免疫层析法免疫测定技术酶免疫测定法：ELISA放射免疫测定法化学发光免疫分析酶免疫组化技术免疫胶体金技术免疫电镜技术3、免疫标记技术2021/1/521第三节免疫细胞的检测一、免疫细胞的分离（一）外周血单个核细胞的分离（二）淋巴细胞及其亚群的分离1.玻璃粘附分离法2.尼龙毛分离法3.E花结分离法4.免疫吸附分离法（洗淘法）5.免疫磁珠分离法（IMB法）6.流式细胞术分离法2021/1/522常用的分离方法：

葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。一、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，它们是免疫学实验中最常用的细胞。2021/1/5232021/1/524二、淋巴细胞及其亚群的分离2、免疫磁珠（immunemagneticbead，IMB）分离法：将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，使表达相应表面标志的淋巴细胞结合在培养板上，洗脱后即可获得具有相应表面标志的淋巴细胞。例用抗CD4抗体包被聚苯乙烯培养板，可将CD4+T细胞与CD8+T细胞相分离。1、免疫吸附分离法（洗淘法）：免疫磁珠由抗淋巴细胞表面标志的抗体与磁性微珠交联结合组成。将免疫磁珠加入细胞悬液中后，可使表达相应表面标志的淋巴细胞与之结合。然后，在磁场作用下，结合相应淋巴细胞的免疫磁珠吸附在靠近磁铁的管壁上。弃去悬液中游离的细胞，将免疫磁珠结合的细胞分离，即可获得具有某种表面标志的淋巴细胞。该法所获细胞纯度高（93%-99%），活细胞率＞95%，比流式细胞术省时、费用低，操作简单。2021/1/525

荧光激活细胞分类仪（简称流式细胞仪）集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞作多参数定量测定和综合分析。

是借助荧光激活细胞分类仪（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）将荧光抗体标记的细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。3、流式细胞术（flowcytometry）分离法：程序原理将待测细胞悬液与荧光素标记的抗体反应后，在压力作用下（细胞）排成单列经喷嘴喷出形成液滴射流（每个液滴包裹一个细胞）；在液滴射流与高速聚焦激光束相交处，液滴中细胞受激发光照射可产生散射光并激发各种荧光信号；荧光信号被光电检测器接受可转化为电信号；电信号经加工处理存储于计算机中，再用分析软件对数据进行统计处理和图像显示，快速准确获得结果。流式细胞仪的主要用途①定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子；②免疫细胞分类和百分计数；③白血病和淋巴瘤的免疫学分型；④细胞周期和细胞凋亡检测。此外，流式细胞仪还具有分选功能，借助光电效应、微滴通过电场时出现不同偏向，可分类收集所需的细胞及其亚群。分选纯度高达95%以上，且可保持细胞活性，可进一步研究使用。2021/1/5262021/1/527一、淋巴细胞功能测定二、免疫细胞功能测定（一）T细胞增殖试验1、特异性T细胞增殖试验：2、非特异性T细胞增殖试验：（二）B细胞增殖试验1、抗体形成细胞测定试验（溶血空斑试验）：2、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：（三）细胞毒试验3、凋亡细胞检测法2、乳酸脱氢酶释放法1、51Cr释放法形态学检测法琼脂糖电泳法TUNEL法流式细胞术检测法二、吞噬细胞功能测定（一）中性粒细胞趋化功能的测定（二）中性粒细胞吞噬功能测定（三）巨噬细胞吞噬功能测定2021/1/528一、淋巴细胞功能测定第三节免疫细胞功能测定（一）T细胞增殖试验T细胞增殖试验是检测机体细胞免疫功能常用的技术。根据刺激物不同，T细胞增殖可分为两种方式：1、特异性T细胞增殖试验：用某种特异性抗原如结核菌素（OT）刺激相应抗原特异性T细胞活化，并使之增殖。2、非特异性T细胞增殖试验：是用丝裂原（如PHA、ConA）或抗CD3单克隆抗体等非特异性多克隆激活T细胞，并使之增殖。在增殖过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质合成增加，细胞形态改变，最终导致细胞增殖分化。常用检测方法：2021/1/529（一）T细胞增殖试验1、3H-TdR掺入法：取外周血单个核细胞（PBMC）与PHA共同培养，在终止培养前8-15小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR

）。在细胞增殖过程中，

3H-TdR可掺入细胞新合成的DNA中，掺入量与细胞增殖水平成正比。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活性，可反映细胞的增殖状况。该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，且易发生放射性污染。常用检测方法：2021/1/530（一）T细胞增殖试验2、MTT法：

MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑。取外周血单个核细胞与PHA共同培养，在培养终止前数小时加入MTT。常用检测方法：在细胞增殖过程中，MTT可掺入细胞，并作为胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成褐色甲臜颗粒。甲臜生成量与细胞增殖水平成正比，当甲臜被盐酸异丙醇或二甲基亚砜溶解后，借助酶标测定仪检测细胞培养物OD值，即可反映细胞的增殖水平。

该法灵敏度不如3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。2021/1/531（二）B细胞增殖试验1、抗体形成细胞测定试验：又称溶血空斑形成细胞试验（plaqueformingcellassay，PFC）或溶血空斑试验（hemolyticplaqueassay）可用来检测产生抗体的B细胞数量。方法①将绵羊红细胞免疫4天后的小鼠脾细胞（内含绵羊红细胞致敏的B细胞——抗体形成细胞）与绵羊红细胞在凝胶介质中混匀；②倾注于平皿板进行孵育，使抗体形成细胞（antibodyformingcell，AFC）周围的绵羊红细胞被AFC产生的抗体致敏；③在平皿板表面加豚鼠新鲜补体进行二次孵育，致敏绵羊红细胞激活补体而发生溶解，在AFC周围出现肉眼可见的溶血空斑。

一个溶血空斑代表一个抗体形成细胞（浆细胞），通过计算溶血空斑数目即可得知B细胞增殖分化和产生抗体的能力。溶血空斑试验可分为直接法和间接法。上法为直接溶血空斑试验法，可用来检测分泌IgM的抗体形成细胞。检测分泌IgG或其它类别Ig的抗体形成细胞须用间接法。间接法前两步与直接法相同，第三步需先加入抗IgG或其他类别Ig的抗体（抗-抗体）后，再加豚鼠新鲜补体进行观察。2021/1/5322021/1/533（二）B细胞增殖试验2、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：方法与原理用已知抗原包被固相载体（硝酸纤维素膜/PVDF膜），加入相应抗原致敏的B细胞（抗体形成细胞）共同孵育后，当抗原致敏的B细胞通过膜表面抗原识别受体（mIgM）接受固相表面相应抗原刺激后，可分泌抗体并与固相表面相应抗原特异性结合；去除细胞和未结合的抗体，加入酶标记第二抗体，通过底物显色，可在分泌抗体的B细胞所在处呈现有色斑点。

一个斑点代表一个抗体形成细胞（浆细胞），通过计算斑点数目即可得知B细胞增殖分化和产生抗体的能力。2021/1/534（三）细胞毒试验1、51Cr释放法：方法与原理将Na251CrO4标记的靶细胞与待检效应细胞（CTL或NK）按一定比例混合培养一定时间后，若效应细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr可从破坏的靶细胞内释放。应用γ计数仪测定培养上清中51Cr的放射活性（cpm），即可反映效应细胞的杀伤活性。本试验是根据细胞毒性T细胞（CTL）和NK细胞可直接对某些靶细胞产生杀伤作用建立的，主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。常用检测方法计数公式：细胞毒活性（%）=最大释放对照孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值试验孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值×100%2021/1/535（三）细胞毒试验2、乳酸脱氢酶释放法：方法与原理将效应细胞与靶细胞按一定比例混合孵育，若靶细胞被杀伤，则存在于胞内的乳酸脱氢酶（LDH）释放。用光度计测定培养上清液中乳酸脱氢酶活性（通过加入LDH底物显色），根据计算公式可获得效应细胞的杀伤活性。计数公式：细胞杀伤活性（%）=最大释放对照孔OD值-自然释放对照孔OD值试验孔OD值-自然释放对照孔OD值×100%2021/1/536（三）细胞毒试验3、凋亡细胞检测法：靶细胞与效应细胞相互作用后，可通过细胞凋亡途径损伤破坏。（1）形态学检测法：凋亡细胞形态学主要特征为体积缩小，胞质浓缩；核染色质密度增高，呈现浓染的半月状、斑块状或核着边现象；细胞膜内陷形成凋亡小体。（2）琼脂糖电泳法：凋亡细胞DNA可被核酸酶在核小体单位之间随机切断，产生180-200bp（核小体单位长度）及其倍数的寡核苷酸片段，在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱，借此可判定细胞凋亡。靶细胞凋亡的检测方法

2021/1/537（三）细胞毒试验（3）TUNEL法：在细胞培养液中加入末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl，TdT）和生物素标记的核苷酸，TdT能在游离的DNA3/端缺口连接标记的核苷酸，利用亲和素-生物素-酶放大系统，在DNA断裂处显色，可标示凋亡细胞。（4）流式细胞术：本法所用标记核苷酸多为dUTP，故称TUNEL法（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling）凋亡细胞因核断裂呈亚二倍体，用FACS分析亚二倍体数目，可指示细胞凋亡程度；凋亡细胞表面暴露的膜磷脂成分，能与荧光标记的磷脂结合蛋白（annexinV）结合，采用FACS分析，可检测悬浮细胞中凋亡细胞的频率。2021/1/538二、吞噬细胞功能测定吞噬细胞包括中性粒细胞和巨噬细胞。用外周血单个核细胞分离的方法，收集红细胞上层即为中性粒细胞。中性粒细胞在趋化因子（如细菌、补体裂解产物C3a/C5a、IL-8等）作用下，可定向移行聚集到感染炎症部位，发挥非特异性抗感染免疫作用。在体外，测定中性粒细胞向趋化因子移行的数量和距离，可得知其趋化功能的强弱。（一）中性粒细胞趋化功能的测定常用方法：

1、琼脂糖平皿法

2、微孔滤膜法2021/1/539趋化移动指数计算公式用含有小牛血清的培养液制备琼脂糖凝胶板，然后在凝胶板同一直线上打三个孔间距相等的孔，中孔加待测中性粒细胞悬液，两侧孔分别加趋化因子和对照用培养液；凝胶板置湿盒内37℃，5%CO2温浴2-3小时后，用戊二醛固定，取琼脂层染色，干后置显微镜下或用摄影仪放大，测定中孔中性粒细胞从孔缘向两侧移行的距离。中性粒细胞向对照孔移动的距离表示其随意运动的能力。2、微孔滤膜法：又称Boyden小室法1、琼脂糖平皿法移动指数=趋化运动移行的距离/随意运动移行的距离特制48孔趋化小室，被孔径为3μm的聚碳滤膜分为上下两室。上室加待测中性粒细胞悬液，下室加趋化因子或对照培养液。将趋化小室置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育30分钟，上室内中性粒细胞迁移至滤膜朝下的一面，即细胞面，滤膜另一面为非细胞面。取下滤膜，将其非细胞面在盛有PBS缓冲液的平皿中沾湿后，在清洗片上洗去非细胞面上的细胞。再将滤膜置甲醇液中固定，经Giemsa染色后，在高倍镜下计数，随机选取5个视野，计数细胞取均值。趋化指数=实验组趋化的细胞数/对照组趋化的细胞数，趋化指数大于2时有意义。2021/1/540（二）中性粒细胞吞噬功能测定1、显微镜检查法：将中性粒细胞与白色念珠菌或表皮葡萄球菌共育一定时间后，取样制片，经美蓝染色后，在油镜下观察中性粒细胞对细菌的吞噬情况，计数吞噬细菌和未吞噬细菌的中性粒细胞数及每个中性粒细胞吞噬的细胞数。按下列公式计算吞噬率和吞噬指数吞噬率（%）=（吞噬细菌的中性粒细胞数/200个中性粒细胞）×100%吞噬指数=200个中性粒细胞中所吞噬的细菌总数200个吞噬细菌的中性粒细胞×100%2021/1/541（二）中性粒细胞吞噬功能测定2、硝基蓝四氮唑试验：在抗凝血或白细胞悬液中加入硝基蓝四氮唑（nitrobluetetrazolium，NBT）溶液后，由于中性粒细胞在杀菌过程中产生的超氧阴离子（O2-）能使被吞入细胞内的NBT还原成不溶解的暗蓝色甲臜，而成为NBT阳性细胞。因此光镜下计数NBT阳性细胞百分率，即反映中性粒细胞的杀伤功能。3、荧光标记物试验：将荧光标记的生物颗粒（如大肠杆菌、白色念珠菌等）与白细胞悬液混合，温育一定时间后加入台盼蓝并洗涤，以去除未被吞噬的荧光颗粒，