分光光度分析技术

第三节分光光度分析技术有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光光度技术(分光光度法)主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的发展，比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光通过滤光片产生，谱带宽度为40-120nm，精度不高，而分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3-5nm，在紫外光区可到1nm以下。单色光通过棱镜或光栅产生，具有较高的精度。一、基本原理分光分析法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert和Beer定律。1、Lambert定律：一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。2、Beer定律：当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著。3、Lambert--Beer定律及其应用如果将通过溶液后的光线强度(I)和入射光(I0)的比值称为透光度(T)，将用光密度(OD或D)表示该溶液对光线吸收的情况(有的也用吸光度A表示)；则它们之间的关系如下：其中：k为常数，称为消光系数(E)，表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。OD(或A)=ECL(1)从公式(1)可知，对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。(2)如果C2为标准溶液的浓度，则可根据测得的光密度值，按公式(2)求得待测溶液的浓度。实际工作中为简便起见，常常事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以光密度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质的光密度后，便可从标准曲线上查到相应的浓度数值。二、分光光度技术的基本应用1、测定溶液中物质的含量可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液(浓度已知的溶液)和未知液(浓度待测定的溶液)的吸光度进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的，也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：⑴灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；⑵可以避免其它物质的干扰。2、用紫外光谱鉴定化合物使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线，方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。三、分光光度计的操作(以721型为例)这是一种采用光电管为受光器的较高级可见光分光光度计，其波长范围360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好。使用方法如下：1、灵敏度选择钮放在“1”档(如调不到“0”的选用较高的档)。2、转动波长选择钮，选用所需的波长。3、接通电源(指示灯亮)。4、揭开比色杯暗箱盖，转动“0电位器”使电表指针对准T=0处。5、将比色杯放入比色杯架，使空白管对向光路，盖好比色杯暗箱盖。转动“100电位器”，调准电表指针使之指向OD=0(T=100)处。6、拉动比色杯座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出光密度值并记录。测读过程中，随时推回拉杆到原位，使空白杯进入光路，并转动100电位器，使指针回到OD=0处。7、比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。使用分光光度计的注意事项：1、分光光度计属精密仪器，应精心爱护使用，防震防潮，防腐蚀。2、比色杯的好坏对光密度读数的影响很大，要保持比色杯的清洁，保护光学面的透明度，不能手握光学面也不能用粗糙的物体接触光学面，比色杯中的液体应适量，不应过满，比色杯外壁的液体应用擦镜纸擦干，以防腐