免疫学技术专题知识

免疫学技术专题知识免疫学技术专题知识第1页经典免疫学方法：一、凝集反应（agglutination）细菌、红细胞等颗粒性抗原与对应抗体结合后形成凝集团块反应。1、直接凝集反应2、间接凝集反应3.间接凝集抑制反应免疫学技术专题知识第2页免疫学技术专题知识第3页二、沉淀反应（precipitation）血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与对应抗体结合后出现沉淀物反应。1、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）2、双向免疫扩散（doubleimmunodiffusion）3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫电泳（rocketimmunoelectrophoresis）5.免疫浊度测定（immunonephelometry）免疫学技术专题知识第4页免疫学技术专题知识第5页免疫学技术专题知识第6页免疫学技术专题知识第7页免疫学技术专题知识第8页免疫学技术专题知识第9页免疫浊度测定:可溶性Ag+Ab，二者百分比适当时，在特殊缓冲液中快速形成一定AgAb复合物，使反应液出现浊度。透射比浊法散射比浊法速率散射比浊法终点散射比浊法免疫学技术专题知识第10页免疫学技术专题知识第11页一定要保持抗体过量,以维持抗原－抗体复合物相对不溶解性。免疫学技术专题知识第12页该方法分析范围主要检测是血浆、体液中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、炎性反应蛋白、一些小分子量治疗性药品浓度等。免疫学技术专题知识第13页第一节

免疫学检测常见标识技术免疫学技术专题知识第14页免疫标识技术（immunolabellingtechnique）指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标记抗体或抗原进行抗原—抗体反应。优点:高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。总体分为:免疫组化:定位检测组织或细胞中Ag/Ab免疫测定:定量检测液体标本中Ag/Ab也可分为:荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标识技术等。免疫学技术专题知识第15页一、酶免疫技术基础原理:以酶标识抗体（或抗原）用于免疫检测，经过对应底物被酶解后显色反应，对标本中抗原/抗体进行定量、定位分析。标识物:酶（催化底物:生物放大作用）特点:灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标识试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，轻易与其它技术偶联衍生出适用范围更广新方法。免疫学技术专题知识第16页（一）常见酶和酶作用底物1.辣根过氧化物酶（HRP）HRP起源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成复合物。HRP常见底物有：（1）邻苯二胺（OPD）

OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在致癌性，显色反应需避光。（2）四甲基联苯胺（TMB）TMB经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最广泛。但水溶性差。免疫学技术专题知识第17页2.碱性磷酸酶（AP）AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。AP价格较HRP高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一段时间（405nm）。免疫学技术专题知识第18页

（二）酶免疫技术分类酶免疫组化

（EIH）

均相酶免疫测定（HEI）

酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定（EIA）

液相酶免疫测定（同RIA）免疫学技术专题知识第19页（三）酶免疫测定（EIA）

1.均相酶免疫测定（HEI）特点:仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，整个检测过程都在均匀液相中进行。以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例:

免疫学技术专题知识第20页2.非均相酶免疫测定（1）液相酶免疫测定（液相EIA）:同RIA:抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应到达平衡，再加分离剂。（2）固相酶免疫测定（固相EIA）:AgAb反应在固相载体表面进行，应用最广泛是酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay——ELISA）免疫学技术专题知识第21页1）ELISA基础原理将抗原或抗体结合到固相载体表面,并保持其免疫活性。抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体,仍分别保持其免疫活性和酶活性。在固相载体上按照一定步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原,洗去未结合游离物质,加入酶底物显色,颜色深浅与待测物质含量呈相关性。免疫学技术专题知识第22页2）固相载体种类A、塑料制品聚苯乙烯：蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板形式

专用于ELISA微量反应板——ELISA板（812=96孔）B、微颗粒高分子单体聚合成微球或颗粒，带有能与蛋白质结合功效基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均匀分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。C.膜载体NC膜（硝酸纤维素膜）、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应用于斑点-ELISA等。免疫学技术专题知识第23页3）ELISA方法类型及反应原理A.双抗体夹心法此法是检测大分子抗原常见方法。上述方法亦可改为双位点一步法,使用针反抗原分子上两个不一样表位单克隆抗体,分别作为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。免疫学技术专题知识第24页B.间接法此法是测定抗体常见方法。能够用一个酶标抗抗体检测各种抗体。免疫学技术专题知识第25页免疫学技术专题知识第26页C.竞争结正当可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于固相酶标抗原量与标本中待测抗原含量呈反比。免疫学技术专题知识第27页D.捕捉法——最常见于检测IgM抗体

包被抗人IgM链+待测标本IgM类抗体全被固相抗体捕捉洗涤+特异性抗原（针对待测IgM对应抗原）与固相上特异性IgM结合+酶标抗体（针对特异性Ag）+底物显色显色表示有特异性IgM。免疫学技术专题知识第28页E、BAS-ELISA生物素（B）-亲和素（A）系统（biotinavidinsystem,BAS）是以生物素和亲和素含有独特结合特征为基础,它们结合快速、专一、稳定,并含有多级放大效应。应用生物素亲和素放大系统ELISA,使反应信号放大,检测灵敏度提升。

免疫学技术专题知识第29页1个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物1个抗体可结合多个B,与蛋白质-NH2结合形成肽键,-NH2越多,标识B越多。E

BAg?

E—B—A—B—EBAbB

BB

EE—B—A—B—E免疫学技术专题知识第30页BAS-ELISA包含:

ABC-ELISA（间接法、双抗体夹心法）

BA-ELISA（间接法、双抗体夹心法）

BAB-ELISA（间接法、双抗体夹心法）

比如:BAB-ELISA（双抗体夹心法）:

固相Ab+待检Ag+（Ab-B）+A+B-E+底物显色免疫学技术专题知识第31页ABC-ELISA（间接法、双抗体夹心法）免疫学技术专题知识第32页（四）酶免疫组化（EIH）原理:以酶标识抗体与用于对应抗原反应，经过底物被酶解显色以示踪抗原-抗体结合物存在部位。酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长久保留。另外，作为辣根过氧化物酶底物二氨基联苯胺（DAB），其分解产物为不溶性，适于镜下观察。免疫学技术专题知识第33页1、直接法组织标本待测抗原+酶标识抗体——DAB显色2.间接法组织标本待测抗原+Ab1+酶标-二抗使用一个酶标抗体可检测各种抗原。敏感性较直接法高，但低于PAP法。免疫学技术专题知识第34页3.生物素-亲和素法将亲和素（A）与生物素（B）系统应用于酶免疫组化包含：ABC法（直接法、间接法）BAB法（直接法、间接法）BA法（直接法、间接法）免疫学技术专题知识第35页3.

1）ABC法直接ABC法:玻片Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-AB*C特点:将BAB法中A先与B·E结合，制备成复合物ABC间接ABC法:用生物素化第二抗体与抗原抗体复合物结合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BABCAg-Ab1-Ab2·B-AB*C免疫学技术专题知识第36页2）BAB法（桥联亲合素-标识生物素法—BRAB）直接BAB法:组织切片或细胞涂片Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特点:以游离A分别连接B·Ab和B·E间接BAB法:用生物素化第二抗体与抗原抗体复合物结合组织切片或细胞涂片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BAAg-Ab1-Ab2·B-AB·EAg-Ab1-Ab2·B-A-B·E免疫学技术专题知识第37页3）BA法（标识亲合素-生物素法——LAB法）直接BA（或LAB）法玻片Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特点:以A·E/SA·E代替BAB法中A，省却了加B·E步骤间接BA（或LAB）法:用生物素化第二抗体与抗原抗体复合物结合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BA·EAg-Ab1-Ab2·B-A·E免疫学技术专题知识第38页

BAS试验方法及反应层次

方法反应层次

直接法BAAg—(Ab-B)—A*BABAg—(Ab-B)—A—B*ABCAg—(Ab-B)—AB*C

间接法BAAg—Ab1—(Ab2-B)—A*

BABAg—Ab1—(Ab2-B)—A—B*

ABCAg—Ab1—(Ab2-B)—AB*C

Ag抗原；Ab-B生物素化抗体；

A亲合素；A*标识亲合素；

B生物素；B*标识生物素；

Ab1第一抗体；Ab2第二抗体;Ab2-B生物素化第二抗体免疫学技术专题知识第39页4.过氧化物酶-抗过氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidasecomplex，PAP）法和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（alkalinephosphatase-antialkalinephosphatase，APAAP）法原理：应用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性、稳定酶-抗酶抗体复合物。此法优点是：未经化学交联反应，故防止了抗体和酶活性降低，并省去酶标识抗体需纯化繁复过程。免疫学技术专题知识第40页二、荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）原理:以荧光素标识抗体或抗原，用于对应抗原或抗体分析判定。荧光免疫技术分为:免疫荧光显微技术（荧光免疫组化）:用荧光抗体对细胞、组织切片或其它标本中抗原（或抗体）进行判定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察试验结果，流式细胞术:进行自动分析检测荧光免疫测定:用于检测体液标本中抗原或抗体。免疫学技术专题知识第41页（一）常见荧光色素1、异硫氰酸荧光素（FITC）

橙黄色/黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰490—495nm，最大发射峰520—530nm，含异硫氰基N=C=S。应用最多荧光素。2、四乙基罗丹明（RB200）

橘红色粉末，发出橘红色或橙色荧光。最大吸收峰570nm，最大发射峰595—600nm。含磺酸基。与FITC做双标识或对比染色。3.藻红蛋白（R-RE）发出橙色荧光，最大吸收峰565nm，最大发射峰575nm，可与FITC共用488nm激发光，可用于流式细胞仪双标识。免疫学技术专题知识第42页（二）免疫荧光显微技术1.方法及原理1）直接法应用特异性荧光抗体直接检验标本中对应抗原。2）间接法以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标识抗球蛋白抗体（标识抗抗体）为第二抗体，用于检测抗原或抗体。免疫学技术专题知识第43页3）补体法此法是在间接法第一步抗原-抗体反应加入补体,使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标识抗补体抗体进行示踪。4）双标识法此法用异硫氰酸荧光素（FITC）及罗丹明（TRITC）分别标识不一样抗体,进行同一标本荧光染色,若有两种对应抗原存在,可同时见两种（橙红、黄绿）荧光。免疫学技术专题知识第44页2.荧光显微镜检验1）染色标本尽可能马上观察结果。2）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。3）通风很好暗室中进行。4）油镜检验时用无荧光镜油，先观察对照，再对待测标本。

免疫学技术专题知识第45页（三）流式细胞术（FCM）FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快速、准确分析和自动检测，并可对不一样类型细胞进行分选和搜集。FCM还可对同一细胞各种参数（如DNA.RNA.蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用一项新技术。免疫学技术专题知识第46页1.基础概念与原理FCM是一个分析单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）物理和化学特征技术，其特点是快速、准确、客观，能定量。FCM原理：悬浮在液体中分散细胞单个地依次经过测量区时产生电信号，从而可快速对大量细胞进行多参数检测和分析，并可从整个群体中分选出特定细胞亚群。免疫学技术专题知识第47页免疫学技术专题知识第48页2.流式细胞术在免疫细胞研究中应用1）细胞表型分析表型分析可用于免疫细胞判定、计数和功效评价。2）细胞功效检测（1）细胞功效状态和活化信号转导：包含检测胞内钙离子浓度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性状态、信息传递相关蛋白表示及相互作用等。免疫学技术专题知识第49页（2）细胞增殖:应用活细胞染料5’-二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯（5’-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE）作为标识物，建立了检测细胞增殖新技术。原理:CFSE能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借助FCM检测荧光强度，可判断细胞增殖状态。免疫学技术专题知识第50页（3）细胞分化:借助胞内细胞因子染色（intracelluarcytokinestaining，ICCS），可应用FCM检测单细胞产生和分泌CK，从而判断单一细胞亚群分化和功效状态。原理:应用蛋白转运抑制剂使胞内合成CK滞留在高尔基体；应用透膜剂（saponin）使荧光标识抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内染色。免疫学技术专题知识第51页（4）细胞毒效应:经过检测一些效应分子（FasL、穿孔素和颗粒酶等）可判断细胞毒效应。（5）细胞凋亡:见下文。免疫学技术专题知识第52页（四）荧光免疫测定（FIA）1.荧光偏振免疫测定（FPIA）该法主要用于小分子物质（尤其是药品浓度）测定。原理：荧光素标识已知抗原+待测抗原+抗体——形成标识抗原抗体复合物，因为其分子量大，旋转慢，在激发光照射下，吸收偏振光多，发出偏振荧光强，小分子游离标识抗原旋转快，其偏振荧光弱。所以，标本中抗原浓度越高，形成标识抗原抗体复合物越少，发出偏振荧光越弱。反之，发出偏振荧光越强。免疫学技术专题知识第53页2.时间分辨荧光免疫测定（TR-FIA）原理：应用含有较长荧光寿命镧系螯合物（如铕）标识抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，有效消除非特异性本底荧光干扰，所得信号完全是镧系螯合物发射特异荧光，从而最大程度提升测定方法灵敏度和特异性。免疫学技术专题知识第54页免疫学技术专题知识第55页3.酶免疫荧光测定（ELFIA）原理：应用含有潜在荧光物质作为酶底物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光测量仪进行定量测定。免疫学技术专题知识第56页三、放射免疫技术是以放射性核素作为示踪剂标识免疫测定方法,其特点是将核素分析高灵敏度与抗原-抗体反应特异性相结合。广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药品和肿瘤标志物定量分析,对相关学科发展起到了极大推进作用。包含放射免疫测定（RIA）和免疫放射测定（IRMA）免疫学技术专题知识第57页（一）常见放射性核素射线：131I、125I、51Cr、60Co射线：14C.3H、32P射线半衰期长，易造成对环境污染，比活性差，需液体闪烁仪。普通不用。免疫学技术专题知识第58页（二）放射免疫测定（RIA）1.RIA基础原理以放射性核素标识抗原（Ag*）和检品中待测未标识抗原（Ag）与固定量特异性抗体竞争结合反应。若Ag*和Ab量固定，二者结合所形成Ag*-Ab复合物受Ag含量制约。若反应系统中Ag含量高，其对Ab竞争结合能力即强，Ag-Ab复合物生成量增加，Ag*-Ab复合物则相对降低。所以，Ag*Ab复合物形成量与Ag含量间呈一定负相关函数关系。免疫学技术专题知识第59页Ag*+Ab

Ag*Ab+Ag*

+

Ag

AgAb+Ag

BFB0T

免疫学技术专题知识第60页2、RIA测定方法1）AgAb反应2）B.F分离加入PR试剂（二抗和PEG混合物，也可制成固相二抗（二抗与颗粒固相物连接）Ag*Ab1+Ab2——Ag*Ab1-Ab23）放射性强度测定

——计数仪测上清/沉淀cpm，制备标准曲线（B/（B+F），B/F，B/B0）。亦可用计算机处理。免疫学技术专题知识第61页（三）免疫放射测定（IRMA）1、单位点IRMA是将待测抗原与过量标识抗体直接反应，然后加入固相抗原免疫吸附剂与游离标识抗体结合经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从而推算出检品中待测抗原含量。2.双位点IRMA测定固相上cpm数免疫学技术专题知识第62页四、化学发光免疫技术是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合自动化仪器分析技术,当前已趋替换RIA而成为免疫检测广泛采取分析技术。可用于多项指标检测。可测定内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药品浓度、骨代谢指标和贫血类等方面检测。

免疫学技术专题知识第63页（一）化学发光免疫测定（CLIA）CLIA是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）标识抗体或抗原,免疫反应完成后,直接引发化学发光反应进行检测。免疫学技术专题知识第64页（二）化学发光酶免疫测定（CLEIA）CLEIA抗原-抗体反应步骤与酶免疫测定相同,仅酶促反应所用底物为发光剂,经过化学发光反应进行检测。免疫学技术专题知识第65页（三）电化学发光免疫测定（ECLIA）

ECLIA实际上是在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应。三联吡啶钌RU(bpy)32+三丙胺（TPA）.免疫学技术专题知识第66页电化学发光免疫分析示意图免疫学技术专题知识第67页电化学发光免疫测定示意图免疫学技术专题知识第68页五、免疫金标识技术（immunogoldlabellingtechnique）氯金酸（HAuCl4）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被还原成原子金,聚合成特定大小金颗粒悬液,并因为静电作用成为一个稳定胶体状态——胶体金。是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原-抗体反应。胶体金含有高电子密度,最初主要用于免疫电镜技术,以后其应用范围逐步扩展。在免疫组化方面,胶体金标识抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中抗原或受体,并可在普通光学显微镜下观察。在流式细胞术中,胶体金可作为多参细胞分析和分选有效标识物。免疫学技术专题知识第69页常见方法：1.免疫金（银）染色法（IGS/IGSS）组织切片（抗原）+特异性抗体+胶体金标记二抗+银显影剂，标识物上金颗粒催化硝酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物上形成黑色“银壳”，使Ag位置放大，从而提高了镜下可见度。

免疫学技术专题知识第70页用NC膜或微孔滤膜为载体吸附抗原,用胶体金标识抗体代替酶标抗体。2.斑点免疫层析试验（DICA）免疫学技术专题知识第71页六、免疫印迹技术（immunoblotting）又称为Western-blotting,是将凝胶电泳高分辨力与固相免疫测定结合起来一个方法。由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）、蛋白质转印和固相膜免疫测定三项技术结合而成。免疫学技术专题知识第72页七、免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）是将免疫学反应和PCR技术相结合而创建一个新检测技术，含有抗原、抗体反应特异性和PCR技术高效性。基础原理:用一段已知DNA分子作为标识物，结合一抗或二抗后去检测对应抗原或抗体，再用PCR法扩增该DNA分子，扩增产物用琼脂糖电泳定性，依据该DNA分子存在是否，确定检测结果。该方法与ELISA原理类似，不一样是以DNA分子作为标识物。免疫PCR可采取直接法、间接法和双抗体夹心法。免疫学技术专题知识第73页免疫学技术专题知识第74页八、细胞凋亡检测技术（一）形态学检测①应用电子显微镜或普通光学显微镜直接观察细胞大小、凋亡小体和其它凋亡细胞形态学改变；②应用一些可直接、间接产生荧光染料[如双苯并咪唑（HO）、碘化丙啶（PI）、AnnexinV等]使细胞着染,借助荧光显微镜区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。免疫学技术专题知识第75页（二）生物化学检测方法凋亡细胞染色质DNA在核小体单位间连接处断裂，形成180~200bp整数倍寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。（三）免疫学检测方法原理:凋亡细胞染色质DNA断裂而产生核小体DNA，可与组蛋白结合为复合物。应用抗组蛋白和抗DNA单抗，借助ELISA方法可测定细胞凋亡。该技术优点是:①可用于检测不一样培养细胞株或不一样动物起源细胞凋亡；②灵敏度高，且可检测早期细胞凋亡。免疫学技术专题知识第76页（四）分子生物学检测方法常见技术为脱氧核糖核酸末端转移酶介导缺口末端标识法（TUNEL），原理:凋亡细胞DNA链发生断裂而暴露3’-OH末端，可借助末端转移酶（TdT）将脱氧核糖核酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成衍生物标识到DNA3’-OH末端，从而检测细胞凋亡。TUNEL法优点是:能对完整单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色；适合用于不一样本检测；灵敏度远比普通组织化学和生化测定法高。免疫学技术专题知识第77页免疫学技术专题知识第78页（五）流式细胞术1.亚“G1”峰检测法处于增殖周期细胞，其在不一样周期时相（Go/G1.S、G2/M）DNA含量为2n~4n。凋亡细胞核内DNA裂解成小片段，应用胞膜通透剂可使小分子量DNA片段穿过胞膜而丢失，仅剩大片段DNA，这些失去个别DNA细胞，染色后形成一个DNA含量＜2n（即＜G1期细胞）分布区，称为“亚G1峰”。该技术缺点为：不能反应发生于G1峰后S期和G2期细胞凋亡；不能区分死细胞和活细胞。免疫学技术专题知识第79页2、HO/PI染色法原理：HO被活细胞摄取，与DNA结合后在紫外光下呈蓝色荧光；PI使死细胞着染，产生红色荧光。依据两种荧光所形成细胞二维直方图，可分辨正常活细胞、凋亡细胞和死细胞。3.Annexin法应用AnnexinV，AnnexinV是一个Ca2+依赖磷脂结合蛋白，含有易于结合到磷脂类如PS（磷脂酰丝氨酸）特征。对PS有高度亲和性。借助FCM可定量分析被标识凋亡与坏死细胞数。免疫学技术专题知识第80页4.caspase活性检测caspase（胱天蛋白酶）水平及活性升高乃细胞凋亡标志，并反应效应细胞细胞毒活性。应用能透过胞膜caspase荧光底物，其被酶切后释放荧光基团，借助FCM检测所释放荧光强度，可推断caspase活性。该法优点为：可在单细胞水平反抗原特异性T细胞细胞毒作用进行可视化和数量化分析。免疫学技术专题知识第81页第二节

免疫分子检测免疫学技术专题知识第82页一、免疫球蛋白测定检测IgG、IgA.IgM含量常见单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法以及免疫化学自动分析仪。血清中IgE和IgD含量很低，须用RIA.ELISA.RAST等灵敏度较高方法测定。免疫学技术专题知识第83页二、补体测定（一）血清总补体活性测定原理:应用家兔抗SRBC抗体致敏SRBC作为抗原-抗体复合物，激活待测血清中补体经典路径，造成SRBC溶解；若待测血清样品中补体含量降低或某种补体成份缺失，可影响此种溶血反应。通常以50%溶血作为判定反应结果终点，故称为50%溶血试验（50%complementhemolysis，CH50）。依据引发50%溶血所需最小补体量，计算血清总补体活性。免疫学技术专题知识第84页（二）血清补体旁路路径活性测定原理：家兔红细胞（RRBC）可直接激活人B因子，引发补体旁路路径活化，造成RRBC溶解。（三）补体各成份测定1、免疫溶血法该法可用于C4.C2及B因子测定。以抗体致敏SRBC作为指示系统进行检测。2、免疫化学法常见方法有单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法、ELISA及RIA等。免疫学技术专题知识第85页三、细胞因子及其受体检测（一）生物学检测法原理为:依据CK特定生物学活性，采取对应指示系统（如各种依赖性细胞株或靶细胞），经过与标准品对比，判断样品中细胞因子活性水平，普通以活性单位（U/ml）表示。可分为促进细胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、细胞毒活性测定法、细胞病变抑制法、趋化活性测定法等。免疫学技术专题知识第86页生物学检测法优点:灵敏度高（达pg水平），并能直接显示CK生物活性。生物学检测法缺点:各种CK可能含有相同功效，故干扰原因较多；一些抑制因子可降低CK活性；一些细胞同时表示CK受体，其与CK结合将影响生物学活性检测结果。免疫学技术专题知识第87页（二）免疫学检测法1.体液中CK检测几乎全部CK均可借助免疫学方法进行检测。常见方法包含ELISA（双抗体夹心法或竞争法）、RIA及免疫印迹法等。一些细胞因子含量甚微样品（如脑脊液）可用免疫PCR（immuno-PCR）进行检测，极大地提升检测灵敏度（可达1012mol/L）。免疫学技术专题知识第88页2.单个细胞分泌CK检测（1）反向溶血空斑试验（reversedhemolyticplaqueassay，RHPA）RHPA是一个体外检测抗体分泌细胞试验。亦可将其用于测定CK分泌细胞。原理：待测CK分泌细胞+抗CK抗体+SPA-SRBC+补体，4种成份与琼脂糖凝胶混匀，注入小室内；反应后造成SRBC溶解，在CK分泌细胞周围形成溶血空斑，每个空斑代表一个CK分泌细胞，空斑大小与细胞所分泌CK量成正比。免疫学技术专题知识第89页（2）酶联免疫斑点试验（ELISPOT）原理:抗CK抗体包被固相载体+待测分泌CK细胞+结合后洗去细胞+酶标抗CK抗体+底物，显色反应深浅测定结合在固相载体上CK量，并可在光镜下观察分泌CK细胞。免疫学技术专题知识第90页免疫学技术专题知识第91页3.细胞内CK检测采取FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不一样细胞亚群中CK，用不一样颜色荧光标识抗CK抗体可在同一细胞内同时测定两种不一样CK。免疫学技术专题知识第92页免疫学检测法优点:①特异性强，可测出单一细胞因子含量；②方法简便，无须细胞培养，便于大量样品检测；③试验流程短，方法易标准化，重复性好免疫学检测法缺点:①免疫学方法所检出细胞因子含量，与该因子生物活性并非必定平行；②不一样单抗所识别细胞因子表位和亲和力不一样，所测结果可出现差异。免疫学技术专题知识第93页（三）分子生物学检测法应用细胞因子cDNA探针或寡核苷酸探针,经放射性核素（32P或35P）、生物素或地高辛标识,与提取细胞因子mRNA进行杂交（Northernblot）；亦可在细胞或组织切片上进行原位杂交分析；若同时结合免疫组化技术,还可判定表示细胞因子基因细胞类型。免疫学技术专题知识第94页分子生物学检测法优点:特异性高。分子生物学检测法缺点:仅能检测CK基因表示情况，不能直接提供CK含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究CK基因表示与调控。免疫学技术专题知识第95页四、黏附分子检测（一）细胞膜表面AM检测1、间接免疫荧光法——组织细胞表面AM组织切片标本+抗AM单抗+羊抗小鼠IgG荧光抗体，进行间接免疫荧光染色，借助荧光显微镜观察表示AM阳性细胞数。2、间接酶免疫组化法——组织细胞表面AM组织切片标本+抗AM单抗+羊抗小鼠IgG酶标抗体，加入酶底物显色，显微镜观察表示AM阳性细胞数。3.流式细胞术——内皮、淋巴细胞等表面AM待检细胞悬液+两种荧光素标识单抗，在流式细胞仪上可同时检测胞膜表面两种不一样AM。免疫学技术专题知识第96页（二）可溶性AM测定1、ELISA双抗体夹心：最常见于检测选择素家族和免疫球蛋白超家族组员。2、其它免疫测定方法：RIA或IRMA.化学发光免疫测定、时间分辨荧光免疫测定方法等免疫学技术专题知识第97页第三节

免疫细胞检测一、免疫细胞分离与纯化（一）白细胞分离1、自然沉降法2.高分子聚合物加速沉降法免疫学技术专题知识第98页（二）外周血单个核细胞（PBMC）分离1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F-H）密度梯度离心法2.Percoll密度梯度离心法（连续和不连续）免疫学技术专题知识第99页（三）淋巴细胞纯化与亚群分离1、去除红细胞普通采取无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。2.去除血小板离心洗涤或胎牛血清（FCS）梯度离心法，因FCS可让单个核细胞经过，而阻止血小板经过。免疫学技术专题知识第100页3.去除单核细胞和粒细胞（1）黏附法玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG-10柱，清除发生黏附细胞（2）羰基铁粉吞噬法单核细胞吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底（3）苯丙氨酸甲酯法苯丙氨酸甲酯含有亲溶酶体性质，用该法可溶解含溶酶体细胞（如单核、粒细胞等）。免疫学技术专题知识第101页4.淋巴细胞亚群分离（1）E花环分离法T细胞表示SRBC受体，能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心，可将T、B细胞分离。（2）尼龙棉柱分离法B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不易黏附，借此可将T细胞与B细胞分离。免疫学技术专题知识第102页（3）亲和板结合分离法（洗淘法）直接结正当:抗体包被塑料平皿或细胞培养瓶（板）+细胞，吸附表示特定抗原细胞。间接结正当:包被抗小鼠IgG抗体（第二抗体）+与单抗结合淋巴细胞，被吸附固定而分离。特异性抗原（配体）包被+表示对应受体细胞，该细胞被分离。免疫学技术专题知识第103页优点:可同时进行细胞阳性分选和阴性分选，且所获细胞量较大。缺点:亲和板结合分离法普通适合进行阴性分选。另外，包被抗体宜采取不含Fc段（Fab’）2抗体片段，以免发生非特异性吸附。免疫学技术专题知识第104页（4）补体细胞毒分离法抗体+细胞+补体,经过补体依赖细胞毒作用（CDC）而去除对应细胞,用于细胞阴性分选。（5）流式细胞术分选法免疫学技术专题知识第105页直接法:将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（IMB），其可与表示对应膜抗原细胞结合；应用强磁场分离IMB及其所吸附细胞，从而对特定细胞进行阴性或阳性分选。间接法:用抗小鼠IgG抗体（第二抗体）包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（一抗）细胞发生反应，从而对细胞进行分离。（6）磁性激活细胞分离器（MACS）分离法

免疫学技术专题知识第106页MACS分离法优点:所获细胞纯度高（93%~99%），获率可达90%，活细胞率＞95%；分离效果可与流式细胞术相媲美，但比后者省时且费用低，操作简单。缺点:阳性分选中，抗体可造成细胞活化或细胞凋亡。免疫学技术专题知识第107页（四）单核-吞噬细胞分离和搜集1、将PBMC经过Percoll连续密度梯度离心法或洗淘法（阳性分选）可获取单核细胞，但所得细胞数量较少。2、斑蝥敷贴法能够从组织渗出液中取得数量较多且较纯巨噬细胞，亦无需作深入分离。3.以灭菌巯基乙醇酸盐肉汤培养基（或无菌液体石蜡）注入小鼠腹腔内，引发无菌性炎性渗出，从腹腔冲洗液中可取得大量巨噬细胞（＞85%）。免疫学技术专题知识第108页二、淋巴细胞及其亚群检测（一）T细胞检测计数1、间接免疫荧光法应用抗CD3/CD4/CD8单抗与PBMC结合，再加入荧光素标识抗小鼠IgG抗体（第二抗体），在荧光显微镜下观察并计数。2、酶免疫组化法1）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）法；2）ABC法（间接法）细胞涂片+单抗+二抗-B+AB*C+底物显色3、流式细胞术采取流式细胞仪计数4.免疫金银染色法（IGSS）免疫学技术专题知识第109页（二）B细胞检测计数1、膜表面免疫球蛋白（mlg）检测细胞涂片+荧光素标识抗Ig抗体（免疫荧光法）/+酶标识抗Ig抗体（酶免疫组化法）2、间接免疫荧光法细胞+CD19/CD20/CD21/CD22等单抗+荧光素标识二抗，判定和检测计数B细胞。3、流式细胞术4.B细胞亚群检测采取流式细胞仪，标识CD5单抗和标识CD19单抗，判定B1细胞和B2细胞。免疫学技术专题知识第110页三、免疫细胞功效测定（一）吞噬细胞功效测定1.中性粒细胞趋化功效测定（1）滤膜渗透法（Boyden小室法）在上室加入待测细胞，下室加入趋化成份，上下室间被含有一定孔径和厚度纤维膜隔开，反应后取纤维膜清洗后进行固定、染色和透明化，在高倍镜下观察细胞穿越纤维膜移动距离，从而判断其趋化作用。免疫学技术专题知识第111页（2）琼脂糖平板法:在琼脂糖平板中央孔内加白细胞悬液，两侧孔内分别加趋化因子或对照液，反应后经过固定和染色，观察细胞定向移动能力。免疫学技术专题知识第112页2.中性粒细胞吞噬、杀菌功效测定（1）显微镜检法白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、温育，取样制片、固定、染色；在油镜下观察多形核白细胞对细菌吞噬情况，计算其吞噬率（%）和吞噬指数（phagocyticindex）及杀菌率。免疫学技术专题知识第113页（2）硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验中性粒细胞在吞噬、杀菌过程中,能量消耗骤增,氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代谢活性增强；葡萄糖分解中间产物6-磷酸葡萄糖在氧化脱氢转变为戊糖过程中,所释放氢被摄入吞噬体NBT染料接收,使其被还原成蓝黑色点状或块状甲臢颗粒,沉积于中性粒细胞胞质内。普通以阳性细胞数超出10%判定为NBT试验阳性。免疫学技术专题知识第114页3、巨噬细胞吞噬功效测定巨噬细胞+鸡红细胞（含有清楚可见胞核）吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数。4.巨噬细胞胞毒作用测定用-干扰素激活小鼠腹腔巨噬细胞，观察其对125I-UdR标识小鼠肥大细胞瘤P815杀伤活性。免疫学技术专题知识第115页（二）T细胞功效测定1、T细胞增殖（转化）试验T细胞在体外受抗原或丝裂原（PHA.ConA）刺激后，细胞代谢和形态发生改变，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，并转变为淋巴母细胞。（1）形态学观察：依据淋巴母细胞转化形态学特征，借助光学显微镜进行检测。优点：方法较简单，无需特殊仪器设备。缺点：依靠肉眼观察形态学改变，准确性较差。免疫学技术专题知识第116页（2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）掺入法:T细胞增殖，其胞内新合成DNA需摄取核苷酸原料，故应用核素标识核苷酸参加反应，经过测定放射性强度可反应淋巴细胞增殖水平。优点:灵敏，可自动