生物技术前沿6基因工程

基因工程

GeneEngineering2011-03-151

2010年诺贝尔生理学或医学奖授予英国生理学家罗伯特·爱德华兹，以表彰他在体外受精技术领域作出的开创性贡献。这一奖励意味着人工生殖技术得到了世界科学界的认同和赞誉，但一直不断的质疑之声依然无法平息。2010年诺贝尔医学奖2011-03-152爱德华兹与世界上第一个试管婴儿路易丝·布朗和她通过自然妊娠方式孕育的孩子2011-03-153拉马克里希南

约纳特施泰茨2009年诺贝尔生理学或医学奖2011-03-154

端粒（telomere）和端粒酶（telomerase）是近年来生命科学研究的热点之一。尤其是染色体端粒、端粒酶与动物及人类的衰老、恶性肿瘤发生的高度相关性，更是成为分子生物学、基础医学、动物学、发育生物学等众多学科关注的焦点。人们对它进行了一系列深入研究，期望能寻找出抗细胞衰老和治疗肿瘤的新途径。2011-03-155端粒是存在于真核生物线性染色体末端，由串联重复的短的dsDNA序列及其相关的蛋白所组成的DNA蛋白复合体。dsDNA中的一条为富G链，以5′→3′指向染色体末端，比另一条互补链长8个～12个碱基，这是端粒DNA分子的结构特征，是端粒酶识别工作的基础。2011-03-156

端粒酶是一种逆转录酶，是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体。其RNA成分中含有与端粒DNA富G链互补的部分，起着合成模板的作用。端粒酶具有对端粒的延伸作用，在没有端粒酶的细胞中，端粒会逐渐缩短直至损害基因；有端粒酶存在的细胞，则该酶会不断补充新的端粒，使之处于一种不断伸缩的动态平衡中。端粒酶的另一个功能是修复断裂的染色体末端。2011-03-157在复制过程中，染色体末端的碱基对会缓慢地丢失，随着每一次的细胞分裂，染色体末端将丢失50~200个端粒核苷酸，所以在连续分裂中，染色体产生进行性缩短，致使末端功能丧失和染色体不稳定，最终导致细胞衰老和死亡。端粒的长度被认为是人体细胞寿命的标志。2011-03-1582011-03-159吕克·蒙塔尼哈拉尔德·楚尔·豪森弗朗索瓦丝·巴尔－西诺西2008年诺贝尔医学奖2011-03-1510

基于豪森教授的发现，人类研制出了两种能够预防女性第二常见癌症——宫颈癌的有效疫苗。而在上世纪80年代，巴尔－西诺西和蒙塔尼成功复制出一型艾滋病病毒（HIV-1）基因组片段，最终发现了艾滋病病毒循环复制及与主体病毒相互配合的病理，由此确立了诊断艾滋病病毒感染者的方式。2011-03-1511主要内容第一节引言第二节重组DNA技术第四节基因克隆的载体第三节目的基因的获取第五节重组DNA导入受体细胞第六节重组子的筛选与鉴定第七节基因工程的应用2011-03-15121.目的基因的来源主要来源2011-03-15132.获得目的基因的途径（1）限制性酶切法直接分离（2）机械切割法（3）PCR直接扩增（4）化学合成（5）构建基因组文库或cDNA文库2011-03-1514（1）DNA模板变性(90～95℃)

双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。95℃模板2011-03-1515（2）DNA模板与引物复性(37～60℃)

引物(primer):人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同。2011-03-1516（3）DNA链的延伸(70～75℃)DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。理论上25次循环就可以合成225条DNA,实际扩增倍数为1*106～3*106

循环1次2条链2011-03-1517脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内。背景知识核酸的存在形式2011-03-1518DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。

核酸的理化性质背景知识2011-03-1519第四节基因克隆的载体2011-03-1520一、质粒（plasmid）载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础，人工构建的克隆载体。2011-03-1521

（1）具有复制起点（ORI）一般，1个质粒1个ori，少数，1个质粒2个ori，但只有1个有活性；

（2）具有抗菌素抗性基因理想的应有两种抗菌素抗性基因，作为筛选标志

（3）若干限制性内切酶的单一识别位点

插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能

（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数

必备的基本条件2011-03-1522质粒的选择标记

（1）抗菌素抗性

氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Smr）氯霉素抗性（Cmlr）

（2）抗菌素选择原理

不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。2011-03-1523质粒载体的基本结构2011-03-15243.质粒载体命名：p：plasmid，

BR：F.Bolivar和R.L.Rodriguez322：实验编号（１）长度4363bp

3.1pBR3222011-03-15252011-03-1526（２）元件①复制起点ori②Ampr基因：氨苄青霉素抗性③Tetr基因：四环素抗性

（３）克隆位点

导致Tetr失活：BamHI、HindⅢ、SalI等；导致Ampr失活：ScaI、PvuI、PstI

2011-03-1527tetr基因的插入

失活效应外源DNA2011-03-1528Ampr/TetrAmps/Tetr2011-03-1529（４）优点

①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择

②分子小，克隆能力大载体越小越好;>10kbDNA在纯化过程中易断裂③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000～3000copy（５）用途基因克隆，构建新克隆载体的骨架2011-03-1530命名：pUC载体由UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于１９７８年发明．来源：在pBR322的基础上，组入了一个lacZ’基因（其5’-端带有一段多克隆位点），而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体。3.2pUC系列

2011-03-1531特点:（1）相对分子质量小（2）元件来源①复制起点（pBR322的ori）②Ampr

基因（pBR322的Ampr基因）③lacZ的启动子（Ｅ.coli）④lacZ’基因（3）多克隆位点

10个连续的单一酶切位点，位于lacZ’基因5’端。（4）选择标记氨苄青霉素抗性和蓝白斑选择相结合。2011-03-15322011-03-1533蓝白斑选择原理：5-溴-4-氯-3吲哚-

-D-半乳糖苷由lacZ’基因编码无色深蓝色2011-03-1534

MCS无外源基因插入时，为蓝菌斑；

MCS有外源基因插入时，为白菌斑。通过直接观察菌斑颜色就能知道是否有DNA插入。2011-03-15352011-03-1536(5)pUC系列载体的优点

①更小的分子量如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp②选择方便

X-gal显色、抗菌素双重直接选择③克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入2011-03-1537第五节重组DNA导入受体细胞

大量扩增和有效表达2011-03-1538原核受体真核受体E-Coli受体系统链霉菌受体系统外源基因复制、扩增和表达场所酵母菌受体系统动物细胞受体系统植物细胞受体系统昆虫细胞受体系统一般只作基因表达场所基因工程的受体系统2011-03-15392011-03-1540区别原核细胞真核细胞大小1~10μm10~100μm细胞壁肽聚糖、蛋白质、脂多糖、脂蛋白纤维素（植物细胞）细胞核无核膜有双层的核膜染色体环状DNA，DNA裸露或结合少量蛋白质线性DNA分子，DNA同组蛋白和非组蛋白结合DNA序列无或很少有重复序列有重复序列基因表达RNA和蛋白质在同一区间合成RNA在核中合成加工蛋白质在细胞质中合成内膜无独立的内膜有，分化成各种细胞器光合与呼吸酶质膜线粒体和叶绿体2011-03-1541细菌细胞动物细胞植物细胞2011-03-1542动物细胞结构图植物细胞结构图2011-03-15431.原核生物细胞原核生物细胞是较为理想的受体细胞：便于外源DNA的进入；没有核膜，便于外源DNA与裸露的染色体DNA重组；基因组小，遗传背景简单，便于对引入的外源基因进行遗传分析；容易获得一致性的实验材料；培养简单，繁殖迅速，实验周期短。2011-03-1544缺点：很多未经修饰的真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物功能活性的蛋白质。常用作受体的原核生物：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、棒状杆菌和蓝细菌等。2011-03-15452.真核生物细胞共性：真核生物细胞具备真核基因表达调控和加工的机制，作为受体细胞表达真核基因优于原核生物细胞。酵母作为基因工程受体细胞的特点：基因结构简单，基因表达调控机制比较清楚培养简单，便于大规模发酵，成本低便于提取加工外源基因表达产物安全，不产生毒素（真菌、植物、动物细胞）2011-03-1546植物细胞作为受体细胞的特点：优点：体细胞具有全能性，获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系；缺点：具有坚硬细胞壁，不利于重组DNA的摄取。多采用动物的生殖细胞、受精卵细胞、胚细胞以及干细胞作为基因工程的受体细胞。2011-03-1547二、重组DNA导入受体细胞2011-03-1548原核细胞E.coli真核细胞植物细胞转化转导三亲本杂交Ti质粒转化法花粉管通道法电穿孔法基因枪法显微注射法激光穿孔转化磷酸钙转染法脂质体介导法精子介导法动物细胞重组ＤＮＡ导入受体细胞的途径2011-03-1549转化（transformation）是将带有外源基因的重组质粒DNA引入受体细胞的技术。转染（transgection）将带有外源DNA的重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的技术；有时也指将外源DNA引入哺乳动物细胞的过程。转导（transduction）将带有外源DNA的重组病毒DNA首先用病毒外壳蛋白包装成为有感染力的病毒，然后用此病毒感染受体细胞，将重组DNA引入受体细胞。2011-03-1550常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2

法：2011-03-15512011-03-1552三亲本杂交法（triparentalmating）