禽流感病毒H7N9危害评估报告

单位名称文件编号：风险评估报告第×版第0次修订第页１背景资料1.1一般生物学特性1.1.1形态结构H7N9禽流感病毒是一种新型禽流感病毒，属于甲型流感病毒中的一种，正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属。病毒颗粒多形性，常为球形，直径一般为80-120nm。其结构由内而外分为三部分：①核心为单股负链RNA，分7～8个片段，与核蛋白（NP）组成核糖核蛋白（RNP），含有RNA多聚酶。核糖核蛋白即呈螺旋对称的核衣壳。核蛋白（NP）抗原很少发生变异，具有型特异性；②基质蛋白（M蛋白），位于包膜与核心之间，抗原性稳定，亦具有型特异性；③包膜，表面有两种由病毒编码的糖蛋白刺突，分别为血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。1.1.2培养特性H7N9禽流感病毒可在鸡胚和细胞中增殖。初次分离接种鸡胚羊膜腔阳性率较高，传代适应后可移种于尿囊腔。细胞培养一般可用原代猴肾细胞或狗肾传代细胞。病毒在鸡胚和细胞中均不引起

明显的病变，需用红细胞凝集试验或红细胞凝集抑制试验证实有无病毒的增殖。

狗肾传代细胞（MDCK）是目前用于禽流感病毒分离培养最常用的敏感细胞系。1.2H7N9禽流感病毒对外环境的稳定性1.2.1对温度，紫外线的敏感性和在自然环境中的存活能力H7N9禽流感病毒对热比较敏感，56℃加热30min或煮沸（100℃）2min可被灭活。病毒在粪便中可存活1周，在水中可存活1个月，在pH<4.1的条件下也具有一定的存活能力。病毒对低温抵抗力较强，在有甘油保护的情况下可保持活力1年以上。在自然条件下，存在于呼吸道和粪便的禽流感病毒由于受到有机物的保护而具有极强的抵抗力，特别是在凉爽和潮湿温和的条件下可存活很长时间。病毒在干燥尘埃中可存活2周，在1.2.2对化学消毒剂的敏感性H7N9禽流感病毒为有包膜病毒，对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感，在200mL/L乙醚4℃中过夜，病毒感染力被破坏；对氧化剂、卤素化合物、重金属、乙醇和甲醛也均敏感，10g/L高锰酸钾、1mL/L汞3min，750mL/L乙醇5min，1mL/L碘酊5min，1mL/L盐酸3min和1mL/L甲醛30min，均可灭活H7N9进行物体表面消毒时，可按照先上后下、先左后右的方法，用0.2％～0.5％过氧乙酸溶液或有效氯为1000～5000mg/L的含氯消毒剂溶依次进行喷雾消毒。地面消毒由外向内喷雾一次，喷药量为200～300mL/m。，待室内消毒完毕后，再由内向外重复喷雾一次。以上消毒处理的作用时间应不少于60min。对室内空气进行消毒，可采用0.2％～0.5％的过氧乙酸或3％过氧化氢，按20mL/m3的量，使用气溶胶喷雾的方法消毒1h，消毒结束后进行通风换气。1.3H7N9禽流感病毒的致病性H7N9禽流感病毒对禽类无明显致病性，但对人群的致死率较高。临床表现为急性发病，早期表现类似普通流感，主要为发热，体温大多持续在39℃1.4H7N9禽流感病毒的传播途径及暴露的后果1.4.1传播途径H7N9禽流感一年四季均可发生，以冬季、春季最为严重。可经多种传播途径感染，主要方式是水平传播。感染途径主要是呼吸道，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。感染禽能在粪便中排出大量病毒，污染一切物品，如饲料、饮水、设备、笼具、蛋筐、蛋盘、动物、飞沫、衣服、运输车辆等。这些均可成为病原的机械性传播媒介。人员的流动与消毒不彻底，也可导致病毒的传播。病禽类的分泌物、排泄物、羽毛及其污染的水等含有大量病毒，人们通过与其密切接触可感染。病毒可通过黏膜、破损皮肤、消化道、呼吸道进人体内。这些含有感染性的污染物受外力的作用可形成病毒气溶胶从而在空气中扩散(一定的时间和距离)、沉积在各种物体表面上；当人体吸人病毒气溶胶后可能导致感染发病，病毒气溶胶沉积在人的黏膜、破损皮肤或食物上也可引起感染。此外，呼吸道分泌物受到呼气、咳嗽、叫唤等作用进入空气后形成的微笑的飞沫及其“飞沫核”也有很强的感染力。实验室操作可能发生感染的途径主要有：大量活病毒操作时形成的感染性气溶胶传播。实验室相关活动，包括检验、诊断、研发等。可能接触的危险样本包括血液、体液、分泌物、排泄物、细胞、组织、尸体、培养物，实验室废物等。实验室操作所致的感染途径主要为呼吸道和皮肤黏膜系统。在样本采集、运输、检测、培养检定、病毒浓缩、动物实验、病毒灭活、储存、废物处理货其他相关的工作（如实验室内务、设施设备维护、意外事件处理等）过程中，因管理、操作、方法和防护不当，或意外事件等均可能造成实验室源性感染。工作过程中（如感染动物、注射、解剖、样品采集、样本处理、接种、离心、培养、制备、废物处理等）产生的有害气溶胶，工作表面污染，锐器伤害，动物抓咬，消毒灭菌不彻底，标识不清，防护不当、失误和意外事件等。所以，H7N9禽流感的传播媒介和侵入途径是多种多样的，在操作中应采取综合防护措施。1.4.2暴露后果在进行活病毒的操作时，如咽拭子、肺组织、血液标本的处理和病毒的分离实验，检测所用的标本为疑似H7N9禽流感病人的咽拭子、肺组织和血液标本。故这些标本中可能含有活病毒，但是浓度不同。在进行H7N9禽流感病毒效价测定实验时，利用鸡胚或96孔培养板对多次扩增后的病毒进行效价测定，通常病毒滴度可达10⁴～106TCID50/mL。病毒保存时，冻存管中的病毒悬液一般为0.5～1mL/管，滴度等同于经细胞或鸡胚扩增后的病毒。在H7N9禽流感病毒RNA提取试验中，实验用的是病例的咽拭子，由于临床疑似病人标本和上述各种实验过程所用到的病毒培养物相比，病毒浓度要小得多，因此，在提取之前有一定传染性，但是裂解后无感染性。1.5H7N9禽流感的预防、诊断和治疗1.5.1预防1.5.1.1免疫接种目前的季节性流感疫苗不能预防H7N9禽流感病毒感染。需采取早发现、早报告、早隔离、早治疗，以及控制管理传染源为主的综合性防治措施1.5.1.2化学药物预防在抗流感病毒的药物中，神经氨酸酶抑制剂，如扎那米韦和达菲，对H7N9禽流感病毒有一定的治疗和预防效果。1.5.1.3实验室防护本实验室未发生H7N9禽流感病毒感染事件。其他实验室发生的类似实验室感染事件报道如下：1987年，澳大利亚动物健康实验室的一名实验室人员进行新城疫病毒溶液浓缩实验。该实验人员没有按照标准操作进行，忘记检查用于浓缩病毒溶液的滤器安装是否正确。当进行过滤时，带有感染性的病毒溶液意外喷溅到实验人员的脸和头发上。意外事件发生后，该实验人员立即中止实验，使用纱布擦拭眼睛和头发的病毒溶液，并清理现场，离开实验室前淋浴2次。3d后，该实验人员出现了眼结膜炎症状。在这个案例中，个人防护不完备是造成他们感染的重要原因。另外，感染者已经出现了相关症状，实验室负责人没有采取有效措施进行隔离和治疗，这很有可能造成病毒的进一步扩散。因此，对于已经发生的感染事件，绝不能掉以轻心，一个错误的决定有可能产生严重的后果，甚至会影响到整个人群的健康。针对前述可能出现实验室感染的环节：离心时，使用带盖的密封离心机；严格按照生物安全操作规范，病毒培养操作时，要求实验操作务必轻柔规范，并且要求使用负压设施；实验操作过程中，佩戴符合生物安全标准的防护器材包括：口罩、帽子、手套和隔离衣等；定期进行生物安全耗材的评价、评估工作；进行动物实验，动作轻柔最大限度地减少气溶胶产生的可能性。1.5.2诊断H7N9禽流感病毒的早期快速诊断主要是病毒的核酸检测。一旦出现疑似病例，应采集病人呼吸道分泌物并提取核酸做荧光定量RT-PCR检测或RT-PCR检测，并对产物进行测序验证。另外，也可采集病人的双份血清进行微量中和实验，作为确诊的依据。1.5.3治疗在感染控制方面首先对疑似和确诊患者进行隔离治疗。要采用对症治疗，可应用解热药、缓解鼻黏膜充血药、止咳祛痰药等。儿童忌用阿司匹林或含阿司匹林，以及其他水杨酸制剂的药物，避免引起儿童Reye综合征。应在发病48h内应用抗流感病毒药物。对于神经氨酸酶抑制剂奥司他韦（Oseltamivir，达菲），成人剂量为每日150mg，儿童剂量为每日3mg/kg，分2次口服，疗程5d。中医药使用要及早，采取清热、解毒、化湿、扶正祛邪。同时，加强支持治疗和预防并发症，注意休息、多饮水、增加营养，给易于消化的饮食。抗菌药物应在明确或有充分证据提示继发细菌感染时使用。重症或发生肺炎的患者应人院治疗，对出现呼吸功能障碍者给予吸氧及其他呼吸支持，对发生其他并发症患者应积极采取相应治疗。2危害程度分类2.1分类等级H7N9禽流感是《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类呼吸道传染病。其病原体在《人间传染的病原微生物名录》中危害程度为第二类的病原微生物。运输包装A类，UN编号：UN2814。2.2不同实验室操作生物安全实验室级别要求根据《名录》要求：在实验室操作涉及病毒培养、分离鉴定、血凝试验、微量中和实验等大量活病毒的操作需要在BSL-3实验室完成；未经培养的实验操作，如临床标本的处理、核酸提取需要在BSL-2实验室中进行；无感染性材料的操作，如灭活后的血清抗体检测可在BSL-1实验室中进行。3风险评估与控制措施3.1人员相关的风险3.1.1人员数量人员过少会因为工作量增大而导致操作过程中工作失误增加，风险增加，同时，为满足《病原微生物实验室生物安全管理条例》要求需要人员基本数量为2人。3.1.2思想素质由于工作与高致病性病原微生物接触机会较多，同时此类物质属高风险材料，涉及生物恐怖、人员安全、环境安全与社会安定，所以对于人员政治思想素质要求较高，需要选择是思想品德良好、责任心强、关心他人利益的人员参与该项工作。3.1.3身体状况（生理、心理素质与免疫状态）实验室工作人员必须在身体状况良好的情况下进入BSL—2实验室工作，人员的健康应当符合实验室的工作要求，下列情况下不能进入（发生严重的发热性疾病、卡他性炎症以及有近期较深的开放性伤口的人员应该禁止或限制其进入相关实验操作区；限制在妊娠早期的工作人员进行相关的感染性材料的操作）；检测人员在上岗前应建立个人健康档案，进行定期的健康体检和适当的免疫接种；若操作者或其所在实验室的工作人员在此期间出现流感病毒感染相应症状或者体征时应停止实验，并立即报告实验室负责人，采取相应的后续报告、处置措施。3.1.4理论基础与技术素质实验室安全负责人熟悉相关的微生物学方法及操作规范，具备微生物学和生物化学，同时具备基础的物理学和生物科学的技术背景；实验人员具有病原微生物检测相关的学历教育背景，从事病原微生物实验室工作时间累积达一年以上，具备相应工作技能与经历，能独立开展相关检测工作。3.1.5生物安全培训需求实验人员上岗前均须接受严格的生物安全以及相关操作的技术培训，包括实验室设施、设备、个体防护、操作等培训。同时必须熟悉和严格遵守实验室的管理要求。3.2活动的风险3.2.1活动背景资料3.2.1.1计划开展的活动内容本实验室主要从事禽流感病毒核酸检测。3.2.1.2计划实施的实验室操作禽流感样品处理、禽流感病毒核酸检测。3.2.1.3涉及的菌毒种背景资料本实验的检测标本来源于本县外环境监测样品和疑似禽流感病例的咽拭子样本。3.2.2工作人员实验活动的生物风险3.2.2.1样品的接收与开启【可能危害】◆标本转移过程中可能会发生病毒采样管脱落或倾倒，造成感染性物质溅出同时产生气溶胶。◆标本离心、震荡、挤压或者开启过程中产生气溶胶。◆如果实验台的台面和其他部位存在锐角设计，有可能在意外发生时造成工作人员皮肤损伤和防护用品破裂，从而感染致病性生物因子。【控制措施】◆样本开启时在生物安全柜中操作，使用移液器时要保证与吸头连接紧密，使用带滤芯的吸头，动作要轻柔。◆实验操作过程中台面铺上浸有消毒剂的纱布或一次性吸水纸。◆在BSL-2实验室内禁用易碎玻璃器皿。◆一旦发生标本管脱落或倾倒等意外，马上将污染的纱布或纸弃入含有10%有效氯的次氯酸钠的消毒液内，并立即消毒台面并更换新的纱布或吸水纸。3.2.2.2核酸检测【可能危害】检测标本滴落污染台面、移液器受污染、吸头未置密封的回收容器内均可造成操作环境的污染；扩增过程扩增管盖的开启致大量核酸外泄造成污染；检测过程中一次性手套破损未更换需污染人体。【控制措施】◆严格执行PCR功能分区，防止病原核酸和环境双向污染。◆PCR过程中使用的吸头不随意丢弃，要回收至密闭容器内，移液器吸入污染物时要及时消毒。◆实验操作过程中台面铺上浸有消毒剂的纱布或一次性吸水纸。◆当手套发生破损时及时更换。◆扩增时扩增管盖应盖严密，不要打开，如需取样要在生物安全柜内操作。◆吸液时容易溅出，污染工作台面，应事先在工作台面铺浸有消毒液的纱布或吸水纸。使用完后将其高压灭菌，按感染性废物处理，避免感染性物质的扩散；◆样品容器使用塑料制品，正确地使用盖子或塞子盖好后无泄露，在容器外不留有残液；◆若手接触感染材料，用75%的消毒后脱掉最外层的手套，换一副新手套，并用75%的酒精纱布擦拭手接触过的物体表面，将污染的纱布放在医用垃圾袋内，进行高压处理。3.2.3外部人员的活动风险外部人员，包括机构外部参观实验室的人员、送样人员、合作人员及临时维修人员等，可能无意进入实验污染区，而该类人群既无生物安全防护意识、知识与技能，也不会使用个人防护用品，一旦接触污染，更容易导致感染事故的发生。【控制措施】严格限制外部人员的活动范围，防止人员误入工作区域。采取硬件屏障隔离，如门禁系统，生物危险标识等进行管理。3.2.4安全防护设备3.2.4.1生物安全柜如果没有按照设备操作规程或使用说明书进行操作、维护，可能使生物安全柜的气流异常，失去安全防护效果。风险的【控制措施】◆按照生物安全柜操作使用规程进行操作。◆生物安全柜使用时观察窗不要抬得过高，柜内尽量少放仪器和物品，不要阻塞后面气口处的空气流通。不能挡住前面的空气栅格；禁止柜内使用酒精灯；操作者操作时尽量避免动作幅度过大、尽量减少操作者操作时后面人员走动；风扇在工作前和工作后至少再运行5min；每次使用后进行消毒；及时更换HEPA；仪器仪器定期进行检定和维护运行。3.2.4.2高压灭菌器如果没有按照设备操作规程或使用说明书进行操作、维护，可能使高压效果明显降低，失去去污染与无害化的目的【控制措施】◆按照高压灭菌器操作使用规程进行操作。◆按照要求进行化学灭菌效果验证和生物灭菌效果验证。◆每次使用后对仪器设备进行清洁；仪器设备定期进行换水，长期不用需要排干水。3.2.4.3离心机如果没有按照设备操作规程或使用说明书进行操作、维护，可能发生离心管破裂，气溶胶释放【控制措施】◆按照离心机操作使用规程进行操作。◆离心过程中如发生离心管破裂要及时进行消毒灭菌。3.2.5个人防护用品个人防护用品因各人面型而适用于不同型号的防护口罩，不合适的防护口罩将会导致防护效果失效或降低。【控制措施】进行个人适合性测试。3.2.6实验室防护设施设施压差与定向流是防止污染气溶胶污染扩散的主要二级防护屏障，所以设施应保持总压差为－40Pa，并且保持压差均匀，单级压差低于－10Pa时，则不能保证发挥有效的防护效果。【控制措施】定期进行实验室压差测定。3.2.7供应品或服务质量的风险◆样本容器材质：玻璃容器会导致破碎后的污染扩散，同时锐器会导致人员意外的割伤；密封不严的容器容易导致污染物流失，导致污染或感染事故的发生。◆运输包装材料：非UN2814或UN3373包装不能安全有效地防止机械破损，将可能产生污染的扩散。◆消毒灭菌剂：消毒剂产品无生产许可证、过期或配制方法不正确、种类选择不合理，将会导致消毒效果降低、生物灭活能力降低或对物品腐蚀性增加，对皮肤造成刺激等问题产生。◆医疗急救用品：用品种类不合适、不会正确使用、未及时清理维护有期限物品或药剂，导致急用时无法发挥作用。◆废弃物包装：非规范包装容易导致将污染物与生活垃圾混放，导致增加生活垃圾污染风险，同时可能的锐器会无明确的提示而使未接受专业培训的人员发生意外伤害。【控制措施】◆实验禁止使用玻璃材质。◆运输包装使用UN2814包装。◆选择合适的消毒剂，并进行验证。◆定期检查清理医疗急救用品。◆锐器用后不准直接扔垃圾桶，放入利器盒后集中处理。3.3操作方法的风险3.3.1标准检测方法的管理标准方法未正确使用,导致错误操作,降低安全性，导致细菌与病毒的生物活性保留，污染环境或感染工作人员。3.3.2非标准检测方法的管理非标准方法未经有效认证，可能导致灭活方法对细菌与病毒的生物活性的消毒灭菌作用不可靠，降低实验废弃物的安全性，污染环境或感染工作人员。3.3.3安全操作规程的管理标准安全操作规程未能有效执行，或错误操作,降低操作的安全性，导致细菌与病毒的生物活性未能有效去除，污染环境或感染工作人员。【控制措施】◆标准检测方法和非标检测方法需要经过确认。◆严格按照规范操作，进行监督。3.4风险控制信息不足的风险3.4.1确定设施/设备要求的信息对设施/设备正确操作要求的信息不足，可能导致设备误用，不能有效发挥设备的防护性能与功效，降低防护效果。3.4.2识别培训需求的信息对人员培训需求的信息不明确，不能有效地开展培训，满足技能要求，从而降低安全操作效果。3.4.3开展运行控制需提供的信息对运行控制需提供的信息不足可能导致对设施防护效果监控不力，从而疏于安全防范，降低系统防护性能。【控制措施】◆及时通过各种途径获得正确的信息。◆严格按照信息要求开展各种活动。3.5风险评估3.5.1风险的范围、性质、时限性和概率拟开展的上述实验活动操作，如果不采取任何防护措施，固有风险为中度至高度风险，对实验人员感染的可能性较强，对环境污染的可能性较大，风险程度为不可接受。3.5.2可能产生的危害及后果分析如果采取防护措施不力，如不按要求在相应级别的生物安全柜内操作，或实验室防护级别达不到预定要求，或废弃物处置达不到灭菌要求，或污染物不能安全处置，则固有风险仍然不能降低至低风险水平，即对实验人员感染与对环境污染风险仍不可接受。3.5.3确定可容许的风险低风险为可接受风险水平，仍需加强控制措施。3.6风险控制措施及残余风险分析消除、降低与隔离风险的管理措施：建立中心的生物安全管理体系，包括管理手册、程序文件、安全手册与作业指导书及相应的记录表格；开展体系宣贯和人员培训，制定生物安全管理工作计划，开展设施设备安全运行及人员状况符合性监督检查,加强日常监督检查,定期开展内审与管理评审。3.7消除、降低与隔离风险的技术措施开展风险评估、人员管理（人员培训、健康监护、资格授权）、设施设备管理（个人防护用品管理、设备安全性检定、防护性检测与状态监测、实验室设施性能检测与使用监测）、材料管理（样本与菌毒种、废弃物）、标识管理（危险标识、状态标识、逃生标识）、应急管理（应急预案、应急演练）、应急功能与状态（报警、处置、报告）、档案管理（体系文件管理、活动记录管理、新方法的论证）等活动，从设