口腔疾病分子生物学（口腔生物学课件）

口腔疾病分子生物学分子生物学研究的主要方法分子克隆的材料与方法分子克隆的主要步骤特异核酸的检测目的及要求熟悉分子生物学的基本实验掌握与基因有关的基本概念，尤其是重组DNA技术的概念和步骤分子克隆技术DNA分子的无性繁殖技术建立依赖于几种因子的发现与运用限制性内切酶、DNA连接酶、质粒（一）限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。三种限速酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅱ型限制性内切酶具有以下几个特征特定的识别序列，4~6个碱基对在识别序列内固定位置切割，切割后5’–端磷酸基因，

3’-端羟基基团切割后形成粘性或平齐末端（二）DNA连接酶质粒细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达分子2000~50000bpTpGEM

-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap构建质粒的特点Ori区：复制起点Par区：保证质粒均匀分布于子细胞多克隆区：人为构建，便于克隆操作。含有多个单一限制性内切酶酶切点。选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选(四)噬菌体概念是侵染细菌、螺旋体、真菌等的病毒。结构温和噬菌体和毒性噬菌体噬菌斑是分子生物学中重要的DNA载体目前广泛使用的噬菌体有

λ-噬菌体，M13噬菌体，（五）转化、转染、转导转化是指受体菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。细菌种属及细胞壁结构的差异，转化条件和过程均不一样。感受态必须存在。即使同一菌属中，各菌株达到感受态的的条件和时机也存在差别。氯化钙处理大肠杆菌以提高细胞膜的通透性。转染专指受体菌捕获和表达噬菌体DNA分子的过程。转导利用噬菌体颗粒为媒介，将外源DNA转移至受菌体并得到表达的生命过程。分子克隆的主要步骤1.基因文库的建立2.目的基因的筛选3.目的基因的分析分子克隆常用技术DNA电泳：可分离不同分子量的DNA基因转移核酸杂交聚合酶链反应PCR

Ladder1234567891011121314Ladder对临床菌株的第二次PCR扩增产物电泳图谱分析

Lane1~7:临床菌株S.sobrinus;Lane8~14:临床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW核酸杂交原理：在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股SouthernBlot电泳、转移、杂交确定分子量斑点杂交目标序列的存在目标序列的量PCR与龋病相关微生物的定量检测方法细菌形态生化反应免疫反应分子生物学方法----分子探针杂交----RFLP----PCR唾液在与龋病相关微生物检测中的应用在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切变形链球菌和茸毛链球菌唾液在与龋病相关微生物检测中的应用抽提细菌染色体DNA(Igarashietal.1996)----细菌----唾液PCR反应过程第一次PCR反应

预变性:94℃4min

变性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最后延伸:72℃5min

第二次PCR反应唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

Ladder123456第一次PCR的灵敏度

变形链球菌S.mutansIngbritt的数量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的灵敏度

变形链球菌S.mutansIngbritt的数量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

Ladder1234567891011121314Ladder对临床菌株的第二次PCR扩增产物电泳图谱分析

Lane1~7:临床菌株S.sobrinus;Lane8~14:临床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW

abcdefghLadder12345678选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组(MutansStreptococci)染色体DNA为模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.0

0.250.10.750.5

abcdefghLadder12345678选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1

Ladder12345MW1.0(Kb)0.750.50.250.1

Ladder12345MW2.0(Kb)1.00.250.10.750.5ABLane1.chromosomalDNAfromS.mutansIngbritt;2.chromosomalDNAfromS.sobrinus6715;3.salivasamplefromsubjectA;4.salivasamplefromsubjectB;5.salivasamplefromsubjectC.利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和茸毛链球菌S.sobrinus(图A)利用外引物(图B)利用内引物结论套式PCR能快速在人类唾液中同时检测变形链球菌和远缘链球菌。该检测方法有望运用于临床检测,对揭示两种细菌与龋病发生关系的研究具有一定价值。口腔疾病分子生物学生命的主要遗传物质-DNADNA的复制基因表达中心法则基因表达的调节目的及要求

掌握：生命的主要遗传物质；DNA的复制；基因表达及其调节；中心法则。Mid-19thCentury

Mendel’sLawsofInheritance(孟德尔的遗传法则)

1869Nuclein(核素)DeoxyribonucleicAcid-DNA(脱氧核糖核酸)ProteinRibonucleicAcid-RNA(核糖核酸)

FriedrichMiescher,1844-18951910

TheChromosomeTheory

(染色体学说)ThomasHuntMorgan,1866-1945ChromosomeGenesDNAProteinRNA???1944GenesOswaldAvery,1877-1955DNA一、生命的主要遗传物质----DNA（一）对遗传物质的认识什么是遗传物质？蛋白质20种氨基酸DNA四种碱基转化实验的结果说明……核酸的组成、分布及基本化学结构1.高分子化合物；2.单体为核苷酸，其包括：一个磷酸分子、一个糖分子、一个碱基;3.根据核苷酸的组成又分为DNA和RNA；4.DNA与RNA的分布；5.四种碱基：A、C、G、T/UDNA与RNA的区别DNARNA糖脱氧核糖核糖碱基腺嘌呤胞嘧啶鸟嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤胞嘧啶鸟嘌呤尿嘧啶结构双链单链DNA结构的推衍Chargaff’rules:T+C=A+G A=T G=CWatson和Crick推导出：

DNA是两条链组成，相互平行的双螺旋结构DNA复制的特点新合成的子代DNA与亲代DNA完全一样，保证了遗传的稳定性。DNA的复制1.复制子：一个单独的DNA复制单位。每一个复制子都含有一个复制起点序列，又称复制原点，也常含有一个末端序列，复制的过程在此终止。复制是在起始阶段控制的，一旦开始复制，就会继续进行下去，直到复制完成2.参与DNA复制中的酶和蛋白因子DNA多聚酶种类DNA多聚酶Ⅲ是DNA复制的主要合成酶。合成DNA还需要下列因素：DNA的前体材料，四种脱氧核苷三磷酸Mg离子的存在一小段DNA或RNA分子的3’-OH一个DNA模板DNA多聚酶的另一个重要特征是具有3’→5’方向的内切酶功能。DNA复制的方式半保留复制半不连续复制由于DNA多聚酶只能从5’→3’方向合成DNA，因而半保留复制不能完全解释。引导链：5’→3’方向的DNA合成滞后链：3’→5’方向，冈崎片段基因编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。

基因的表达1.DNA的遗传信息是通过蛋白质的合成，再由蛋白质发挥各自特定功能的表达。2.DNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序。3.蛋白质的合成是通过RNA来完成。RNA（单链）信使RNA（mRNA)核糖体RNA（rRNA)转运RNA（tRNA)RNA的生物合成——转录转录:在RNA多聚酶作用下，以DNA为模板合成RNA的过程。由RNA多聚酶合成从DNA上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束内含子与外显子转录的模板和方向：有意义链：模板链（3’→5’DNA链）反义链：非模板链2.RNA多聚酶与启动子

启动子：能特异性地与RNA多聚酶结合，引发RNA合成。从DNA上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束3.转录的起始与延伸4.内含子和外显子的概念原核生物：基因是连续的DNA片段真核生物：基因由若干个不连续的DNA片段组成的。内含子：插入序列，它是位于基因的内部，能够被转录的一段DNA。但在转录后，与之相应的那部分转录产物在拼接中被去掉了。外显子：基因中与成熟的mRNA相对应的DNA片段，它不仅包括蛋白质编码的部分，而且包括5’和3’末端不翻译的前导序列和尾随序列。釉原蛋白基因表达示意图遗传密码的性质所有的密码都是由三个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在3个终止密码子UAA,UGA,UAG，起始密码子：AUG密码子具有兼并性通用性蛋白质的生物合成——翻译蛋白质的生物合成——翻译蛋白质合成过程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白质合成的起始AUG→甲酰化甲硫氨酸（fMet)III.肽链的延伸IV.蛋白质合成的终止终止码UAA、UGA、UAG蛋白质的生物合成——翻译新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修饰Ⅲ.信号肽蛋白质向细胞外分泌基因表达DNA→RNA→蛋白质丰富的生命现象中心法则DNA

RNA蛋白质

子代结构蛋白、酶等生物多样化

转录反转录翻译DNA复制基因表达的调节机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因共同表达的基因：维持细胞基本结构、功能特异性表达的基因：

红细胞产生血红蛋白B淋巴细胞产生抗体、成牙本质细胞分泌牙本质蛋白基因表达调控的原因动力细胞内、细胞间，或细胞与外界环境间关系的变化调节基因，结构基因基因表达调节的方式启动子强启动子与RNA多聚酶有较强的结合能力，转录水平较高；弱启动子则反之。调节蛋白的作用—负调控：乳糖操纵子—正调控：阿拉伯糖纵子乳糖操纵子学说Britten-Davidson模型里顿-戴维逊（Britten-Davidson）协同调节模型1969年提出，1973年补充，1979年修改。该模型认为在个体发育期，许多基因被协同调控，而重复序列在调控中具有重要的作用。设想不连锁基因发生协同诱导是通过结构基因以外的三个遗传因子参与作用。

牙发生的分子机制原发性上皮带发生前庭板（vestibularlamina）

牙板（dentallamina）

外胚间叶

成釉器＋牙乳头＋牙囊＝釉质牙本质牙髓牙骨质、牙周膜牙槽骨早期牙发育上皮间充质相互作用中homeoboxgene和生长因子的表达(http://honeybee.helsinki.fi/toothexp)PrimaryepithelialbandEctomesenchymeIncisorCanineMolarMsx-1andMsx-2Msx-1,Msx-2,Dlx-2Barx-1andDlx-2

Msx-1Msx-2Dlx-2Barx-1根据小鼠下颌牙槽嵴区间充质基因表达所推断的人牙模式发生的相关调控基因一、釉质形成的分子机制（一）釉质的发育分期成釉器发育到钟状期后，牙体组织便进入形成阶段。这时，在将来的牙尖部位依次发生如下变化：①前成秞细胞的分化②前成牙本质细胞和成牙本质细胞的分化③牙本质的形成④成秞细胞的分化⑤釉质的形成牙本质开始形成时，介于成牙本质细胞和成秞细胞间的基板开始破裂，一旦牙本质发生矿化，成秞细胞就开始并分泌釉基质。釉质的发生与成熟可分为釉质分泌期——形态发生釉质成熟期——釉质矿化启动矿化牙本质涎磷蛋白、釉丛蛋白结合矿化离子釉原蛋白、釉蛋白控制晶体生长速度釉原蛋白、釉蛋白、成釉蛋白决定釉柱结构成釉蛋白转导细胞信号釉丛蛋白控制分泌有机基质的降解产物保护矿化相

釉原蛋白、釉蛋白釉质蛋白与釉质发育各阶段种类基因特点致病釉原蛋白AMEL（牙特有）分子量小含量最多釉质发育不全釉蛋白ENAM（牙特有）最早分泌釉质发育不全成釉蛋白AMBN可在成釉细胞瘤表达釉从蛋白TUFT表达短暂釉质矿化结构起作用蛋白水解酶MMP20KLLK4釉原蛋白加工酶降解釉质蛋白釉质