蛋白质的化学

第四章蛋白质的化学第一节蛋白质是生命的物质基础第二节蛋白质的化学组成第三节蛋白质的分子结构与合成原理第四节蛋白质的结构与功能第五节蛋白质的性质第六节蛋白质的分离与纯化的基本原理第七节蛋白质的分类第1页，共123页。第一节蛋白质是生命的物质基础一蛋白质是构成生物体的基本成分蛋白质(protein):是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键(肽键)缩合而成的,具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子.蛋白质存在于所有的生物细胞中,是构成生物体最基本的结构物质和功能物质.

第2页，共123页。蛋白质的分布:蛋白质是细胞中含量最丰富的高分子有机化合物.

占人体总干重的45%,细菌占50-80%,

干酵母47%,高等植物大豆含40%第3页，共123页。二蛋白质具有多样性的生物学功能蛋白质在生命活动过程中有重要的作用：生物催化,酶类，已知的有3000种以上代谢调节，部分激素免疫保护，抗体、干扰素物质的转运和贮存，载体蛋白运动与支持，肌肉、骨骼、鞭毛控制生长和分化，基因表达调控接受和传递信息，配体和受体构成生物膜.第4页，共123页。第二节蛋白质的化学组成一蛋白质的元素组成

蛋白质是一类含氮有机化合物.某些蛋白质还含有微量元素,主要是磷(P)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)和碘(I)等.

N的含量平均为16%：凯氏(Kjadehl)定氮法的理论基础蛋白质的含量=蛋白质的含氮量×100/16=蛋白质的含氮量×6.25第5页，共123页。化学式：C3H6N6第6页，共123页。第68页，共123页。第72页，共123页。第六节蛋白质的分离与纯化的基本原理谷胱甘肽(glutathione，GSH)(一)根据溶解度不同的分离纯化方法带正电荷的极性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸透析:将蛋白质溶液放在半透膜袋内,置于适当的易于与氧结合,使Hb与氧结合的速度大大加快.荷质比:净电荷,大小,形状免疫分离纯化:免疫亲和层析第115页，共123页。第60页，共123页。二.蛋白质的结构的基本单位氨基酸(aminoacids):是蛋白质水解的最终产物,是蛋白质结构的基本单位.

所有蛋白质都由20种基本氨基酸组成.

氨基酸的结构第7页，共123页。第8页，共123页。第9页，共123页。第10页，共123页。20种氨基酸(aa)的结构特点:均为L-氨基酸均为α氨基酸,脯氨酸除外(α亚氨基酸)α-碳原子为不对称碳原子(甘氨酸除外)各种aa的R侧链各不相同第11页，共123页。2.不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,这些氨基酸都由相应的基本氨基酸衍生而来的.其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等.这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：第12页，共123页。三、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类非极性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸不带电荷的极性氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺带正电荷的极性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸带负电荷的极性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸极性氨基酸第13页，共123页。几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2第14页，共123页。

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3第15页，共123页。第16页，共123页。四、氨基酸其他重要的概念必需氨基酸(essentialaminoacid,EAA)：人体体内自身不能合成,必须从食物中获

成人有8种必需氨基酸：赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)色氨酸(Try)

亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)苏氨酸(Thr)

苯丙氨酸(Phe)甲硫氨酸（蛋氨酸）(Met)

婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)

食物蛋白质的互补作用:营养价值较低的食物蛋白质合理搭配、混合食用,从而互补必需氨基酸的不足,提高营养价值.第17页，共123页。2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在280nm附近有一定的吸收.原因：分子中含有苯环(共轭双键).据此可以通过测定蛋白质溶液280nm的吸光值测定蛋白质含量第18页，共123页。3.茚三酮反应氨基酸与水合茚三酮一起加热,生成蓝紫色化合物,在570nm处有最大吸收.可用作aa含量分析.氨基酸与水合茚三酮共热,发生氧化脱氨反应,生成的NH3与还原吲三酮及水合茚三酮脱水缩合,生成蓝紫色化合物第19页，共123页。4.两性解离及等电点不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：

氨基酸所带静电荷为零时,溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(isoelectricPoint),以pI表示pI的用途：分离、纯化和鉴定蛋白质制剂、AA制剂，在药物使用上可改变PI方法延长疗效第20页，共123页。五、氨基酸的分离与分析1.自动氨基酸分析仪2.高效液相色谱(highperformanceliguidchromatography，HPLC)3.离子交换层析4.质谱(MS)第21页，共123页。第三节蛋白质的分子结构与合成原理蛋白质的分子结构分为一级结构和空间结构(二、三、四级结构).一蛋白质的一级结构(primarystructure)一级结构指蛋白质分子中氨基酸残基的种类、数量及排列顺序.包含的共价键主要指肽键和二硫键(disulfidebond).第22页，共123页。(一)肽键(peptidebond)和肽链(polypeptide)肽键：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基

之间失水形成的酰胺键称为肽键.第23页，共123页。肽键特点：组成肽键的原子处于同一平面肽键中的C-N键具有部分双键性质,不能自由旋转肽健C-N:0.133nmC＝N:0.125nmC－N:0.145nm第24页，共123页。肽(peptide):氨基酸借肽键相连而形成的化合物.

二肽,三肽……

蛋白质与多肽并无严格的界线,通常将分子量在

6kDa以上的多肽称为蛋白质寡肽(oligopeptide):由10个以内氨基酸连成的小肽肽链:氨基酸之间通过肽键连接形成的链.

有链状、环状和分支状.氨基酸残基(aminoacidresidue):组成多肽的氨基酸单元.氨基酸在形成肽链时丢失一分子水,分子已不完整.二硫键：两分子半胱氨酸残基的巯基脱氢生成的，可存在肽链内部和肽链之间.第25页，共123页。多肽链的一端含有一个游离的

-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的

-羧基，称为羧基端或C-端.氨基酸的顺序是从N端的氨基酸残基开始，以C端氨基酸残基为终点的排列顺序.如上述五肽可表示为:Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSVYDQSer-Val和Val-Ser是相同的二肽吗？第26页，共123页。多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位生物活性肽:1.谷胱甘肽(glutathione，GSH)功能：GSH是体内重要的还原剂构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的γ－羧基2.促甲状腺素释放激素由下丘脑分泌,促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢)第27页，共123页。3.牛胰岛素结构：第28页，共123页。第29页，共123页。(二)蛋白质一级结构测定的原理一级结构测定目的:知道氨基酸的组成和排列顺序

一级结构确定的原则：将大化小,逐段分析,制成两套肽片段,找出重叠位点,排出肽的前后位置,最后确定蛋白质的完整序列.第30页，共123页。2.1N-末端氨基酸的分析(1)二硝基氟苯法(DNFB)分离DNP-氨基酸，用纸层析、HPLC进行分析该方法已过时首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构第31页，共123页。(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法优点,丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度比DNFB高100倍，产物不必提取直接分析第32页，共123页。(3)Edman降解法(苯异硫氰酸酯法、PITC法、PTC法、PTH法)Edman于1950年首先提出第33页，共123页。(4)氨肽酶法：一种肽链外切酶.能从肽链N端开始逐个切掉氨基酸第34页，共123页。2.2C-末端氨基酸的分析羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链C-端外切酶，目前常用的羧肽酶：A,B,C和Y.种类作用类型A脂肪族或芳香族氨基酸（脯氨酸除外）B碱性氨基酸CC末端的脯氨酸Y几乎所有类型氨基酸（最适用）第35页，共123页。(2)肼解法:也称联氨法.多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成肼化物.肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离.第36页，共123页。3.大分子多肽氨基酸顺序的确定采用两种或多种不同的断裂方法将长肽断裂成两套或多套小肽,并将其分离纯化、分别测序.多肽的选择性降解的方法有：化学法：溴化氰水解法,它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键.酶解法:第37页，共123页。第38页，共123页。利用重叠肽确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠,拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序.第39页，共123页。5.从核酸顺序推导氨基酸顺序原理：通过核酸的氨基酸顺序（三个核苷酸确定一个氨基酸的密码）。优点：对经典化学法难以测定的大分子蛋白质或生物体含量很低的蛋白质很适用缺点：无法提供二硫键的位置等信息第40页，共123页。二蛋白质的构象(conformation)蛋白质的一级结构不具有功能,只有形成正确的结构才具有功能.二级结构以上的结构叫高级结构,高级结构是指各原子或基团在空间上的分布,所以又叫空间结构,或三维结构可分为:二级结构,三级结构,四级结构第41页，共123页。(一)蛋白质的二级结构(secondarystructure)蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠.只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键.主要有

-螺旋、-折叠、-转角.第42页，共123页。1.α-螺旋(α-helix)

由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象Pauling和Corey于1965年提出第43页，共123页。结构要点：天然蛋白质中螺旋的方向大都为右手螺旋(仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋).每3.6个氨基酸螺旋上升一圈,每圈螺旋的高度为0.54nm,每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm,肽键平面与中心轴平行.主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-CO基与第四个氨基酸残基的-NH基形成氢键.是稳定螺旋的主要作用力第44页，共123页。影响α-螺旋稳定性的因素：在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，阻止氢键形成，α-螺旋就不稳定Pro的N上缺少H，不能形成氢键，它改变多肽链的方向并终止螺旋Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，也是螺旋的最大破坏者肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋pH的影响第45页，共123页。（4条α-螺旋）原纤维微原纤维巨原纤维纺锤体型皮质细胞角质膜皮质髓质头发头发结构烫发的生物化学过程第46页，共123页。2.β-折叠(β-pleatedsheet)

-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列,通过链间氢键交联形成.肽链的主链呈锯齿状折叠构象.第47页，共123页。

-折叠的结构要点：肽键平面呈锯齿状排列,侧链Ｒ基团交错分布在片层平面的两侧由氢键维持稳定.其方向与折叠的长轴接近垂直.有两种类型:平行式，即所有肽链的N-端都在同一边:反平行式，即相邻肽链的方向相反每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm.反平行式更稳定.第48页，共123页。3.

-转角(β-turn)也称

-回折或发夹结构，存在于球状蛋白中在

-转角部分，由四个氨基酸残基组成弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，维持构象.经常出现在连接反平行β-折叠片的端头.第49页，共123页。4.无规卷曲(randomcoil)自由回转

无规律的松散肽链结构.常常是酶的活性部位第50页，共123页。(二)超二级结构指二级结构的基本结构单位(α-螺旋,β-折叠等)相互聚集,形成有规律的在空间上能辨认的聚集体.已知的超二级结构主要有αα,βαβ,β-曲折和β-折叠筒等.

是氨基酸侧链相互作用的结果.超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．又称基序或模块（motifs）第51页，共123页。第52页，共123页。(三)结构域(structuraldomain)结构域是球状蛋白质的折叠单位.多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构,具有部分生物功能.第53页，共123页。第54页，共123页。结构域一般由100-200个aa组成,氨基酸可以连续,也可以不连续．结构域之间常形成裂隙,比较松散,往往是蛋白质优先被水解的部位.酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．可作为结构单位进行相对独立的运动,水解后仍能维持稳定的结构,甚至保留某些生物活性．对于较小的蛋白质分子,结构域与三级结构等同,即这些蛋白为单结构域.结构域有时也称功能域,功能域是指有功能的部分.功能域可以是一个结构域,也可以是两个或两个以上的结构域组成.第55页，共123页。(四)三级结构(tertiarystructure)蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠,从而生成特定的空间结构.包括主链和侧链的所有原子的空间排布．

一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面．第56页，共123页。(四)四级结构(quarternarystructure)蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式,内容包括各个亚基在蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系.

这种蛋白质分子中，每一个具有独立三级结构的肽链,称为亚基(Subunit),它一般由一条肽链构成,无生理活性,只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后,才具有生物活性第57页，共123页。由2-10个亚基组成的蛋白称为寡聚体oligomer

更多亚基组成的蛋白称多聚体(polymer)第58页，共123页。(五)维持蛋白质构象的化学键1氢键(hydrogenbond):一个电负性大的原子上的氢和另一个电负性大的原子相互作用形成的键.2疏水键(hydrophobicbond):由两个非极性基团因避开水而聚在一起的作用力.第59页，共123页。3盐键(ionicbond):蛋白分子中正电荷基团和负电荷基团之间的静电吸引所形成的化学键.4范德华引力(VanderWaals):原子,分子,基团间的一种弱作用力.5二硫键(disulfidebond)第60页，共123页。维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键第61页，共123页。三蛋白质空间结构测定1.二级结构测定通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量.

-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而

-折叠的CD谱不很固定第62页，共123页。2.三级结构测定X射线衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法第63页，共123页。四蛋白质和多肽合成的基本原理(一)化学合成法的基本原理氨基酸的基团保护氨基保护基Y：Cbz-Cl(苄氧碳酰氯)：H2/Pd或Na-液氨法去除Boc-Cl(叔丁氧碳酰氯)：稀盐酸法去除第64页，共123页。2.缩合剂：N,N′-二环己基碳二亚胺(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide,缩写DCCI)第65页，共123页。多肽的液相合成(1)氨基酸的基团保护(2)接肽缩合反应(3)除去保护集团循环反应，合成顺序N端到C端第66页，共123页。多肽的固相合成常用固相载体：聚苯乙烯树脂羧基与载体相连.合成方向：C端到N端第67页，共123页。(二)生物技术合成蛋白质1.基因工程(geneticengineering)(DNA重组)2.细胞工程(cellengineering)3.酶工程(enzymeengineering)第68页，共123页。第四节蛋白质的结构与功能一蛋白质一级结构与功能的关系1.一级结构不同,生物学功能各异不同蛋白质有不同功能的根本原因是一级结构的不同.一级结构决定高级结构进而决定功能.第69页，共123页。第70页，共123页。2.一级结构中关键部分相同,功能也相同

ACTH：促肾上腺皮质激素,垂体前叶分泌第71页，共123页。3.一级结构中关键部分变化,其生物活性也改变第72页，共123页。4.一级结构的变化与疾病的关系如镰刀贫血病(sickle-cellanemia),其不正常的血红蛋白(Hb-S)与正常的血红蛋白(Hb-A)的差别：仅仅在于β链的N-末端第6位残基发生变化CTT→CAT第73页，共123页。糖尿病是胰岛素51个氨基酸中仅有一氨基酸残基异常:

这类由遗传突变引起的在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病称作分子病第74页，共123页。高浓度中性盐：盐析作用构成第一个肽键的羧基是第109页，共123页。带负电荷的极性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸第28页，共123页。所有蛋白质都由20种基本氨基酸组成.四蛋白质和多肽合成的基本原理第28页，共123页。蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似,但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物,也就出现了一些新的性质.熔点：180℃（分解）.葡聚糖凝胶(商品名Sephadex)(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法优点,丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度比DNFB高100倍，产物不必提取直接分析在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，阻止氢键形成，α-螺旋就不稳定N,N′-二环己基碳二亚胺结构域之间常形成裂隙,比较松散,往往是蛋白质优先被水解的部位.二蛋白质的空间构象与功能的关系蛋白质分子特定的空间构象是其具有生物活性所必需的.1.蛋白质前体的活化有些蛋白在体内是以无活性的蛋白质原形式合成和分泌的,经过裂解之后才表现出活性.一些酶原和蛋白质.第75页，共123页。例：胰岛素,在刚合成时为前胰岛素原,其的N-末端有一段肽链,称为信号肽.信号肽被切去,变成胰岛素原.其由84个aa组成,仅有10%活性,经水解成一条21个aa的A链,一条30个aa的B链，才有完整的生物活性.第76页，共123页。2.蛋白质的变构现象变构作用(allostericeffect)：又称别构效应,指含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化.以血红蛋白为例：血红蛋白(Hb),四聚体(α2β2),与氧的亲和力很弱,但当氧与Hb分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后.即引起该亚基构象的改变,一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变,易于与氧结合,使Hb与氧结合的速度大大加快.第77页，共123页。3蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象病比如：朊病毒蛋白（PrP)第78页，共123页。三蛋白质的结构与生物进化

同源蛋白：在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.

第79页，共123页。例：细胞色素C,80个物种中,有26个位置上的氨基酸残基完全不变,是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位,属于不变残基.第80页，共123页。

可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关.亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多(进化树)第81页，共123页。第五节蛋白质的性质蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似,但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物,也就出现了一些新的性质.第82页，共123页。一蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定1.蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量一般大于1×104.最高可达4×107(烟草花叶病毒)．2.球形不对称常数接近1

纤维状不对称常数远大于10

椭圆形不对称常数介于中间第83页，共123页。3.分子量测定的方法1)估算分子量方法：

a)根据化学成分测定最小相对分子质量

首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量,假定蛋白质分子中该成分只有一个,据其百分含量可计算出最低相对分子质量：

最小分子量=原子量/组成百分数ⅹ100

如：细胞色素C铁=0.45%，其最小分子量=12237

第84页，共123页。b)根据氨基酸的数目

20种氨基酸的平均分子量为128

肽键个数=缩合失水分子数=氨基酸分子总个数－肽链条数

已知20种氨基酸的平均分子量是128，现有一蛋白质分子由两条多肽链组成，共有肽键98个,问此蛋白质的分子量最接近于（）2)较精确测定分子量的主要方法有超速离心法、分子筛层析法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、生物质谱法等.

11036第85页，共123页。a）超速离心法在60000～80000rpm的高速离心力作用下,蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动,用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度.蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关.沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度,用S表示.一个S单位为1×10-13秒第86页，共123页。相对分子质量越大,S值越大蛋白质的沉降系数：1～200S由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量：第87页，共123页。b)分子筛层析法,也叫凝胶过滤法所用介质为凝胶珠,其内部为多孔网状结构.一定型号的凝胶网孔只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部,大分子则被排阻在外.洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来,洗脱液体积小;小分子在颗粒网状结构中穿来穿去,历程长,后洗脱下来,洗脱体积大.第88页，共123页。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖,商品名:Sephadex先测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数(logM)对Ve作图,得一标准曲线再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量一定范围内:Ve＝K1－K2logM第89页，共123页。c)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS)SDS:十二烷基硫酸钠,变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比:净电荷,大小,形状用SDS和巯基乙醇(打开二硫键)处理蛋白质变性并与SDS结合,形成SDS-蛋白质复合物,使蛋白质分子均带负电.

0.4g-1.4gSDS/1g

此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量第90页，共123页。十二烷基硫酸钠

Sodiumdodecylsulfate

分子式：CH3(CH2)11OSO3Na

分子量：C12H25NaO4S=288.38

性状：白色或浅黄色结晶或粉末.

熔点：180℃（分解）.

十二烷基磺酸钠

Dodecylsulfonicacidsodiumsalt

分子式：CH3(CH2)11SO3Na

分子量：C12H25NaO3S=272.38

性状：白色或浅黄色结晶或粉末.

熔点：300℃.第91页，共123页。水平式电泳装置垂直式电泳装置第92页，共123页。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图，测出待测样品的迁移率，从标准曲线上查出样品的相对分子量.d)生物质谱法更准确的分子量测定方法第93页，共123页。二蛋白质的变性(denaturation)变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响,使蛋白质分子原有的特定的空间构象发生改变,从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失.但一级结构未遭破坏.1.变性蛋白质的特性：变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失溶解度降低,易形成沉淀析出,粘度增加而扩散系数减小结晶能力丧失,分子形状改变,肽链松散,反应基团增加,易被酶消化第94页，共123页。2.变性的因素物理因素:加热、紫外线、X-射线、超声波等.化学因素:酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂(尿素、盐酸胍)、重金属盐等.3.蛋白质的复性(renaturation)除去变性因素后,有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性,这一现象称为蛋白质的复性第95页，共123页。蛋白质的一级结构决定高级结构第96页，共123页。三蛋白质的两性电离与等电点

等电点(pI):在某一pH值溶液中,蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当,蛋白质分子所带正负电荷相等,净电荷为零.此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI).第97页，共123页。四蛋白质的胶体性质蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围,在溶液中能形成稳定的胶体,具有胶体溶液的典型性质如布郎运动、丁达尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能力等.蛋白质的亲水胶体溶液相当稳定：1.表面亲水基团吸引周围的水分子,使水分子定向排列在它的周围,形成“水化层”.2.蛋白质在非等电点时带有同种电荷,同种电荷相斥,使蛋白质分子保持一定的距离而不聚合.+++++++带正电荷的蛋白质第98页，共123页。五蛋白质的沉淀反应(pre-cipitation)当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时,蛋白质就会从溶液中析出,这种现象称为蛋白质的沉淀使蛋白质沉淀的方法:盐析法(saltingout)

向蛋白质溶液中加入大量中性盐低浓度中性盐：盐溶作用高浓度中性盐：盐析作用第99页，共123页。常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等作用原理:盐离子与水亲和力极强,夺去蛋白质的水化层,减少分子间静电斥力特点：不破坏蛋白质的构象,蛋白质不发生变性分段盐析：调节盐浓度,可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出.

如血清球蛋白(50硫酸铵饱和度)

清蛋白(饱和硫酸铵)第100页，共123页。(2)有机溶剂沉淀法原理:使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少,导致蛋白质分子聚集而沉淀.常用有机溶剂:甲醇、乙醇、丙酮缺点：常会使蛋白质变性注意事项:必须低温下操作,尽量缩短处理的时间第101页，共123页。重金属盐沉淀法原理:重金属离子如Hg2+、Ag+、Pb2+等带有正电荷,能与蛋白质分子中带负电基团结合,生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀.

若溶液pH大于蛋白质的pI,沉淀更易发生缺点：此法常使蛋白质变性失活(4)加热:变性导致沉淀第102页，共123页。(5)生物碱试剂和某些酸类沉淀法原理:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等),某些酸类(三氯乙酸、磺酰水杨酸和硝酸等),与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀注意事项:反应溶液的pH<pI,确保蛋白质以阳离子形式存在缺点：此法常使蛋白质变性失活第103页，共123页。六蛋白质的颜色反应第104页，共123页。七蛋白质的免疫学性质1.抗原(antigen,Ag):外源和非自身的能被免疫系统识别并产生免疫应答的物质.免疫原性(Immunogenicity):能刺激生物体产生免疫应答并产生抗体或免疫淋巴细胞的特性.免疫反应性(Specificreactivity):能与所产生免疫应答产物进行结合并发生反应的能力.半抗原(Hapten)-不具免疫原性只具免疫反应性的物质.抗原决定簇(Determinant):是抗原引起免疫应答和与抗体结合反应的基本结构单位.常位于抗原分子的表面,由3-8个氨基酸构成.

分为a.构象决定簇b.顺序决定簇第105页，共123页。2.抗体(antibody,Ab):能与抗原特异性结合,并具免疫功能的球蛋白.免疫球蛋白(immunoglobulinIg)抗体活性及和抗体结构类似的球蛋白家族多克隆抗体(polyclonalantibodies)：针对各种抗原决定簇的许多不同的抗体.单克隆抗体(monoclonalantibodyMcAb)：针对单一抗原决定簇第106页，共123页。抗原抗体反应具有高度特异性3蛋白质免疫性的应用疾病的免疫预防,免疫诊断,免疫治疗免疫分析:放射免疫分析(RIA)酶联免疫分析:(EIA)免疫分离纯化:免疫亲和层析BACK第107页，共123页。第六节蛋白质分离与纯化的基本原理一蛋白质的提取1.材料的选择.含目的蛋白多,来源方便,注意处理过程2.组织细胞破碎.有机械方法、超声法等3.提取分离.合适的溶剂和方法、防止酶解.第108页，共123页。

二蛋白质的分离与纯化(一)根据溶解度不同的分离纯化方法

1等电点沉淀法

2盐析沉淀法

3低温有机溶剂沉淀法

4温度对蛋白质溶解度的响

(二)根据分子大小不同的分离纯化方法

1透析(dialysis)和超滤法(ultrafiltration)第109页，共123页。透析:将蛋白质溶液放在半透膜袋内,置于适当的缓冲液中,小分子杂质(如硫酸铵等)可从袋中透出,而蛋白质保留于袋中,从而将蛋白质纯化.第110页，共123页。

超滤法：利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去,而蛋白质留在膜上.第111页，共123页。2分子筛层析(molecular-sievehormatography)

也叫凝胶过滤(gel-